一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法，属于生物技术领域。根据ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅｂａｎｋ公布的已知ＣＵＣ３基因ｃＤＮＡ序列，设计兼并引物，利用反转录ＰＣＲ技术进行目的片段克隆；筛选的阳性克隆进行酶切、ＰＣＲ鉴定、ＤＮＡ测序以及核苷酸序列同源性比较，获得罗布麻ＣＵＣ３基因的保守区基因片段；构建反义表达载体，通过发根农杆菌途径转化罗布麻；由罗布麻发根途径实现植株再生，以达到控制罗布麻分枝的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于生物

技术介绍
罗布麻是夹竹桃科(^wc戸acefle)罗布麻属0;wQ7mm)的一种多年生宿根草 本植物，它包括罗布红麻(J/WQ7wm vewe^m Zi/m)和罗布白麻C4;wc)7mm Ae^rw/foo)t./.)。罗布麻无论在纤维利用、药用还是保健品开发方面均具有 极高的综合利用价值。国内外现有的报道主要是关于罗布麻纤维脱胶技术的研 究，而对前期的育种、生长特性和如何提高麻纤维质量的研究报道很少。由于罗 布麻分枝较多，既影响种植密度，也难于实现机械化剥麻，直接影响了纤维长度 和产量。野生资源已经远远无法满足不断增长的市场需求。目前，虽然进行了一 些小规模人工种植试验，但分枝多，纤维短及产量低的问题仍然无法解决。因此， 通过现代生物工程技术，利用转基因育种方法减少罗布麻的分枝，培育出分枝少、 纤维产量高的新品种，提高麻皮的质量和产量，不但在控制植物分枝研究方面具 有重要意义，而且所选育新品种的推广将会产生巨大的社会和经济效益。虽然目前对于其它植物的分枝发育调控国内外已有较多研究，但分枝控制涉 及到十分复杂的植物激素调控和信号转导途径。随着一些分枝调控基因和转录因 子的发现，为我们通过转基因技术实现对植物分枝的控制提供了可能。玉米的tbl gene被认为是分枝调控基因(J. Doebley et al. Nature, 1997， 386， 485-488)，此基因 本身有抑制分枝的作用。另外，还有研究通过构建含有MADS-box基因的表达 载体以实现增加农作物和观赏植物分枝的目的(United States Patent No. 6995302)。在Ken-ichiro Hibara和Casper W. Vroemen等对拟南芥的研究中发现， CUC3基因对侧枝发育有重要作用(Ken-ichiro Hibara et al. The Plant Cell, 2006， 18, 2946—2957; Casper W. Vroemen et al. The plant cell, 2003， 15, 1563-1577)。 CUC3基因属于NAC转录因子家族，它对侧枝的发育、器官原基边界的界定和 顶端分生组织的形成发挥主要作用。在拟南芥中抑制CUC3基因，使拟南芥的侧 枝生长受到抑制。最近的研究发现，在侧枝发育方面，CUC3起正调控作用。本 专利技术将反义RNA技术应用于罗布麻，沉默罗布麻的CUC3基因，实现对其分枝 的控制。反义RNA技术是通过与RNA进行碱基配对的方式从复制、转录和翻译等水 平上对基因表达发挥调控作用。目前，反义RNA技术己经广泛应用于植物基因 工程中，成为作物遗传改良的一个重要工具。目前利用反义RNA技术调控植物的基因表达取得了很多进展，有些结果已接近实际应用水平，反义RNA技术已 经渗透到植物学研究各个领域(孟博等.国外医学遗传学分册，2001， 24 (6)， 289-292)，如植物生长发育基因表达调控、农艺性状的改良(许本波等.中国 农学通报，2003， 19 (3) ， 84-88)、次生代谢途径的调控和抗病转基因植物育 种(娄红等，辽宁大学学报，2005， 32 (4) ， 328-333)，并获得了稳定转基因 新品系，具有广泛的应用前景。目前还没有通过反义RNA技术沉默CUC3基因来 控制罗布麻及其他作物和观赏植物分枝的相关报道。虽然国内外已对罗布麻的组织培养进行了一些研究，但尚未建立稳定的再生 体系。本专利技术通过发根农杆菌感染罗布麻外植体，可得到发根，从发根途径可直 接得到再生植株，从而建立了罗布麻稳定的再生体系。与以往对罗布麻组培途径 实现再生的研究相比，这种方法不易产生嵌合体植株，因此，是一种理想且稳定 的转化和转基因植株再生体系。本专利技术通过构建CUC3基因的反义表达载体，利用发根农杆菌途径对罗布麻进 行转化和实现转基因植株的再生，从而实现对罗布麻分枝的控制。本专利技术是一种 对植物实现分枝调控的新途径，同时也为其他作物及观赏植物分枝性状控制提供 了新的思路。
技术实现思路
本专利技术的目的在于应用反义RNA引发的基因沉默技术，设计和构建罗布麻 的分枝调控基因CUC3保守区基因片段的反义表达载体，导致该基因的沉默，抑 制罗布麻的分枝发育，获得分枝少的罗布麻新品种。本专利技术提供了一种应用反义 RNA基因沉默技术控制罗布麻分枝的方法，主要内容包括 1.罗布麻分枝调控基因CUC3保守区的克隆；应用RT-PCR方法，提取罗布麻总RNA反转录产生cDNA，以cDNA为模板 克隆分枝调控基因CUC3保守区基因片段，并根据反义RNA基因沉默原理构建 反义表达载体。1) 克隆CUC3保守区的兼并引物Primerl: 5'-ATTACT/CTTT/CTACTTAGCTTCCAAAA/G -3' Primer2: 5'-CCTTTGT AGAAC/AACC/AAA/G C/TGTC/TT TCTTC-3'2) 克隆到的CUC3保守区cDNA序列及同源性比较克隆到的CUC3保守区cDNA全长为287bp，编码95个氨基酸，将此氨基 酸序列与NCBI Genebank中其它植物编码CUC3基因的核苷酸序列相比较表 明罗布麻CUC3基因保守区与矮牵牛，拟南芥，大豆和水稻相应区域核苷酸序 列的同源性分别为76%、 75%、 75%和74%，与公布的CUC3， CUC2， CUC1 相应保守区氨基酸序列的同源性为77%， 73%， 68%。这说明利用反转录PCR 技术获得了编码罗布麻CUC3基因的保守区cDNA。该保守区的序列如下5SEQ. ID.NO 1的信息a) 序列特征 长度287个核苷酸 类型核酸链型双链b) 分子类型cDNAC)假设否d) 反义否e) 最初來源罗布麻f) 序列描述SEQ. ID.NO 11 ATTACCTTTT ACTTAGCTTC CAAAGTCTTA TACGGACGCT TCTGTGGACT CGACATTGCT121 AGAGAGTGGT ACCTTTTCAG CTTAAGGGAC AGGAAGTACC CAACGGGGCT GAGAACAAAT 181 AGAGCCACTT GTGCCGGGTA CTGGAAAGCA ACGGGGAAAG ATAGAGAAGT CTACGGCAGT 241GAAGGCGTTG TTGTGGGCAT GAAGAAGACA TTTGTnTCT ACAAAGGSEQ. ID.NO 2'的信息(a) 序列特征 长度95个氨基酸 类型氨基酸链型单链(b) 分子类型蛋白质(c) 序列描述SEQ. ID.NO 261RATCAGYWKA TGKDREVYGS EGVVVGMKKT FVFYK2. 基因沉默载体的构建；将RT-PCR的目的产物片段连入克隆载体pEASY-Tl，然后进行DNA序列分 析，测序结果与Genebank中序列进行同源性比较；将测序正确的CUC3基因片 段用ZkJ和Sac/从pEASY-Tl切下，反向插入含有35S启动子和NOS终止子的 表达载体pCAMBIA-1301，构建成反义表达载体pCAMBIA-1301-CUC3。3. 通过发根农杆菌介导的方法进行基因转移； 采用冻融法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法，其特征是：　（１）．罗布麻分枝调控基因ＣＵＣ３保守区的克隆；　应用ＲＴ－ＰＣＲ方法，提取罗布麻总ＲＮＡ反转录产生ｃＤＮＡ，以ｃＤＮＡ为模板克隆分枝调控基因ＣＵＣ３保守区基因片段，并根据反义ＲＮＡ基因沉默原理构建反义表达载体；　ＣＵＣ３基因片段的克隆：从罗布麻无菌种子苗中制备总ＲＮＡ，通过反转录反应产生ｃＤＮＡ第一链，再以ｃＤＮＡ第一链为模板进行ＲＴ－ＰＣＲ反应，根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ中收录的ＣＵＣ３基因保守区的序列设计１对兼并引物，其序列为：　Ｐｒｉｍｅｒ１：５′－ＡＴＴＡＣＴ／ＣＴＴＴ／ＣＴＡＣＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＡＡＡ／Ｇ－３′；　Ｐｒｉｍｅｒ２：５′－ＣＣＴＴＴＧＴＡＧＡＡＣ／ＡＡＣＣ／ＡＡＡ／ＧＣ／ＴＧＴＣ／ＴＴＴＣＴＴＣ－３′　（２）．基因沉默载体的构建；　将ＲＴ－ＰＣＲ的目的产物片段插入克隆载体ｐＥＡＳＹ－Ｔ１，然后进行ＤＮＡ序列分析，测序结果与Ｇｅｎｅｂａｎｋ中序列进行同源性比较；　将测序正确的ＣＵＣ３基因片段用ＸｂａＩ和ＳａｃＩ从ｐＥＡＳＹ－Ｔ１切下，反向插入含有３５Ｓ启动子和ＮＯＳ终止子的表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ－１３０１，构建成反义表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ－１３０１－ＣＵＣ３；　（３）．通过发根农杆菌介导的方法进行基因转移；　采用冻融法将反义表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１－ＣＵＣ３导入发根农杆菌，涂布含卡那霉素（５０－１００ｍｇ／Ｌ）的ＹＥＢ平板后，在２８℃恒温培养箱，培养２天后，挑取单菌落，用ＰＣＲ方法进行检测，检测为阳性的克隆用于感染罗布麻真叶、茎、子叶节，子叶，下胚轴，根等不同外植体部位；　（４）．罗布麻的转化和转基因植株再生；　用导入反义表达载体的发根农杆菌感染罗布麻上述不同外植体部位，感染后的外植体在黑暗条件下共培养２天，然后转至含有５００ｍｇ／Ｌ头孢霉素的ＭＳ培养基，２５±１℃，１４ｈ／１０ｈ光／暗培养，每隔５－７天转接一次，共转接３－５次，感染后约７－１０天产生毛状根，待毛状根长至２－３ｃｍ，用ＰＣＲ方法进行检测，将检测为阳性的根切下转至５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素和３００ｍｇ／Ｌ头孢霉素的芽诱导培养基上进行筛选，待筛选到的芽长至２－３ｃｍ高时，转入生根培养基，经过２－３周培养，转化植株生根并长成完整再生植株；　（５）．转基因植株的检测和筛选；　对转基因植株采取三步法筛选，第一步，通过采用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ方法检测转基因植株的目的基因，第...

【技术特征摘要】
1. 一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法，其特征是(1). 罗布麻分枝调控基因CUC3保守区的克隆；应用RT-PCR方法，提取罗布麻总RNA反转录产生cDNA，以cDNA为模板克隆分枝调控基因CUC3保守区基因片段，并根据反义RNA基因沉默原理构建反义表达载体；CUC3基因片段的克隆从罗布麻无菌种子苗中制备总RNA，通过反转录反应产生cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板进行RT-PCR反应，根据Genebank中收录的CUC3基因保守区的序列设计1对兼并引物，其序列为Primer15′-ATTACT/CTTT/CTACTTAGCTTCCAAAA/G-3′；Primer25′-CCTTTGTAGAAC/AACC/AAA/GC/TGTC/TTTCTTC-3′(2). 基因沉默载体的构建；将RT-PCR的目的产物片段插入克隆载体pEASY-T1，然后进行DNA序列分析，测序结果与Genebank中序列进行同源性比较；将测序正确的CUC3基因片段用XbaI和SacI从pEASY-T1切下，反向插入含有35S启动子和NOS终止子的表达载体pCAMBIA-1301，构建成反义表达载体pCAMBIA-1301-CUC3；(3). 通过发根农杆菌介导的方法进行基因转移；采用冻融法将反义表达载体pCAMBIA1301-CUC3导入发根农杆菌，涂布含卡那霉素(50-100mg/L)的YEB平板后，在28℃恒温培养箱，培养2天后，挑取单菌落，用PCR方法进行检测，检测为阳性的克隆用于感染罗布麻真叶、茎、子叶节，子叶，下胚轴，根等不同外植体部位；(4). 罗布麻的转化和转基因植株再生；用导入反义表达载体的发根农杆菌感染罗布麻上述不同外植体部位，感染后的外植体在黑暗条件下共培养2天，然后转至含有500mg/L头孢霉素的MS培养基，25±1℃，14h/10h光/暗培养，每隔5-7天转接一次，共转接3-5次，感染后约7-10天产生毛状根，待毛状根长至2-3cm，用PCR方法进行检测，将检测为阳性的根切下转至50mg/L卡那霉素和300mg/L头孢霉素的芽诱导培养基上进行筛选，待筛选到的芽长至2-3cm高时，转入生根培养基，经过2-3周培养，转化植株生根并长成完整再生植株；(5). 转基因植株的检测和筛选；对转基因植株采取三步法筛选，第一步，通过采用PCR和South...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵兵，贾海燕，王晓东，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]