【技术实现步骤摘要】
本专利技术属医学领域，涉及一种诱导sars-cov-2 nsp12及其突变体降解的方法，是一种降解新型冠状病毒rna依赖的rna聚合酶(rdrp)转录复合体及其突变体的方法，利用相对温和的热激诱导sars-cov-2 nsp12降解。
技术介绍
1、新型冠状病毒(covid-19)，是一种由新型冠状病毒(sars-cov-2)所引起的急性呼吸道传染性疾病，具有传染性强、传播速度快、致病性较强、防控难度大等特点。新冠病毒的感染致病机制主要包括4个步骤：1、病毒表面刺突蛋白(s蛋白)与人体细胞表面的血管紧张素转化酶2(ace2)结合来感染细胞；2、利用宿主细胞进行病毒基因的复制和翻译；3、在宿主细胞内组装形成大量子代病毒；4成熟子代病毒通过胞吐释放并进入新一轮感染。其中，ace2在人体各组织广泛表达，在肺泡上皮、小肠上皮和血管内皮细胞的表达尤为丰富。因此，sars-cov-2感染人体后可引起以肺脏损伤为主的全身多器官损伤。
2、目前针对新冠治疗的药物主要分为两种，分别是以瑞德西韦(remdesivir)为代表的核苷类药物和以帕克斯洛维德(paxlovid)为代表的蛋白酶抑制剂药物。其中，remdesivir在体外和动物模型上都显示出较好的抗rna病毒活性，但世界卫生组织的一项“团结实验”结果表明，remdesivir对临床新冠病毒患者收效甚微，或是无效。paxlovid由于临床效果显著逐渐成为了新冠治疗的主流药物，但它常常与一些惯用药物产生交叉反应，引起严重的副作用，这大大限制了药物对高危人群的覆盖范围。
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技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种诱导sars-cov-2 nsp12及其突变体降解的方法，是一种非治疗目的的sars-cov-2 nsp12及其突变体降解的新颖方法，通过热激诱导野生型以及更高感染力的突变型sars-cov-2 nsp12降解，进而抑制病毒的复制能力。
2、本专利技术方法通过以下步骤实现：
3、本专利技术主要通过40℃～42℃的具有流动性的媒介(液态包括水、油、酒精、甲醇、乙醚等；气态包括空气、水蒸气、氧气、氮气等；固态包括沙子、黏土等)处理过表达sars-cov-2nsp12野生型以及突变型的293t、hela以及a549细胞或者感染sars-cov-2病毒的vero e6细胞1小时～6小时，从而特异性地诱导致病蛋白sars-cov-2 nsp12降解。
4、本专利技术的另一个目的是提供所述方法在诱导野生型以及突变型nsp12降解中的应用。
5、首先，我们使用体外过表达的方法检测热激对sars-cov-2 nsp12的降解作用，其次选用感染sars-cov-2的vero细胞进一步验证我们的结果。一般来讲，用于过表达的载体细胞比较常见的有293t、hela以及a549细胞。三种细胞都在含10％胎牛血清(fbs)的dmem(购自上海源培)培养液中培养(37℃、5％ co2、饱和湿度)。我们将其按(5～10)×104/ml的浓度接种5ml于t25培养瓶并中过夜培养，用liofectamine2000转染nsp12其突变体，转染后24h再做加热激(40～42℃)处理。细胞的热激是用可控温的恒温水浴锅实现的，既将培养瓶盖紧平整放入调好温度的水浴锅里面处理15min到12h。处理好的细胞样本及时收集放入-80℃冰箱里面保存或者直接提取蛋白。细胞裂解时，向细胞团中加入一定量的含脲素的弱强度ripa裂解液，立即吹打均匀。置于冰上，每隔10min吹打若干次并用涡旋振荡器涡旋。30min后，在13000rpm、4℃下离心30min，取上清，lowrry法定量使各组浓度一致，蛋白溶液置于-80℃冰箱保存或直接western blot上样分析。在热激对病毒复制能力影响的实验中，我们将vero细胞在含10％胎牛血清(fbs)的mem(购自上海源培)培养液中培养(37℃、5％co2、饱和湿度)，并按(5～10)×104/ml的浓度接种5ml于t25培养瓶并中过夜培养，将纯化好的sars-cov-2病毒感染并做热激处理(40℃24h)，通过rt-pcr技术检测病毒的复制能力。
6、本专利技术发现相对温和的热激(40-42℃)能特异性诱导nsp12降解，而对nsp7、nsp8和n蛋白影响不大。更重要的是，热激不仅能够降解普通新冠病毒中的野生型nsp12，而且针对变异株delta和omicron中的nsp12突变体(p323l)，热激同样能诱导其降解。同时，依托生物安全防护三级(p3)实验室，我们发现热激(40℃)在细胞水平上能够有效降低sars-cov-2病毒的rna水平(20倍左右)以及病毒的滴度(减少超过99.5％)，且对细胞生存率无影响，这表明热激能显著抑制sars-cov-2病毒的复制。更重要的是，通过对细胞进行温和的每日连续热激处理(40℃，0.5h·d-1)，nsp12蛋白表达可以维持在一个极低水平。
7、为进一步确认热激诱导nsp12蛋白通过哪种途径降解，我们分别使用蛋白酶体途径抑制剂mg132和溶酶体途径抑制剂cq处理细胞，发现mg132能显著抑制热激诱导的nsp12蛋白降解，而cq则无此作用，这一结果提示热激能够通过促进nsp12的泛素化修饰从而诱导其经泛素-蛋白酶体途径降解。此外，通过检测热激后nsp12的泛素化修饰水平，我们发现40℃热激0.5h能显著增强nsp12蛋白的泛素化修饰。进一步通过对热激后与nsp12结合的蛋白进行质谱检测，对相关结合蛋白进行筛选和验证，最终明确znf598为热激降解nsp12过程中的特异性e3泛素连接酶。
8、综上所述，科学合理地提高呼吸道温度或许能够通过降解病毒内转录复合体进而减少病毒复制，阻止其感染和传播，抑制新冠病毒患者病情恶化。具体实施方法为，通过可温控的浴缸为病人进行逐步升温的热激治疗，刚开始浴缸的温度调到38℃并让病人在其中浸泡10min，然后将温度提升至39℃使病人在其中浸泡20min，最后将浴缸温度调至40℃使病人在其中浸泡30min～1h，而每一天至少保证两次这样的热疗。通过这种逐步升温的方式可以使病人较好地适应高于正常体温的热激治疗，而且在治疗中可以根据病人的个体情况做适当改变例如起始本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种诱导SARS-CoV-2NSP12及其突变体降解的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动性的媒介选用液态的水、油、酒精、甲醇或乙醚，或气态的空气、水蒸气、氧气或氮气，或固态的沙子或黏土。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过40℃～42℃流动性媒介处理。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，泛素-蛋白酶体为主要降解途径。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，ZNF598为参与降解的关键E3泛素连接酶。
6.权利要求1所述方法在诱导野生型以及突变型SARS-CoV-2NSP12降解中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种诱导sars-cov-2nsp12及其突变体降解的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动性的媒介选用液态的水、油、酒精、甲醇或乙醚，或气态的空气、水蒸气、氧气或氮气，或固态的沙子或黏土。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过4...
【专利技术属性】
技术研发人员：那仁满都拉，杨桃，王茜茜，杨畅，亚森·买买提依明，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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