【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其是涉及一种生物催化不对称反应还原酶及其应用。
技术介绍
1、(r)-邻氯扁桃酸甲酯是血小板凝集抑制剂氯吡格雷(clopidogrel)的重要中间体。氯吡格雷由法国赛诺菲-安万特公司于1986年研发成功，临床用其硫酸盐，商品名plavix(波立维)，主要用于治疗动脉粥样硬化等心脑血管疾病；2009年该药品全球销售额达100亿美元，仅次于降血脂药物阿伐他汀，成为全球药品市场排名第二的畅销药物；(r)-邻氯扁桃酸甲酯经过磺酸酯化、亲核取代合成氯吡格雷，反应产率高，产物基本无消旋化。
2、现有技术中，(r)-邻氯扁桃酸甲酯的合成路线主要包括化学合成和生物合成两种方式，化学合成方式会产生污染和重金属残留等问题；如公开号wo2007078176a1公开了采用腈水解酶催化邻氯扁桃甲酯或乙酯，理论产率可到100％，但该方法使用剧毒氢氰酸会造成环境污染；再如van langen等(org.process res.dev.，2003，7：828-831)利用羟基化酶催化邻氯苯甲醛和氢氰酸不对称合成(r)-邻氯扁桃腈，再经水解生成(r)-邻氯扁桃酸，但过程也使用剧毒氢氰酸。再如采用重金属催化剂直接不对称还原邻氯苯甲酰甲酸或其甲酯得到(r)-邻氯扁桃酸或其甲酯，但该反应的产物中会残留重金属污染物。
3、生物合成方式相对于化学方式具有反应条件温和、无环境污染等优势，目前生物合成方式主要采用筛选可直接进行不对称还原邻氯苯甲酰甲酸的菌株和利用不对称还原邻氯苯甲酰甲酸的菌株的还原酶遗传资源构建高效的基因工程重
技术实现思路
1、针对现有技术中生物催化不对称还原酶制备(r)-邻氯扁桃酸甲酯时存在酶反应活性低需要添加辅酶的问题，本专利技术提供了一种生物催化不对称反应还原酶及其应用，该还原酶对邻氯苯甲酰甲酸甲酯具有高反应活性和高(r)-选择性，该还原酶能够和葡萄糖脱氢酶偶联催化反应底物邻氯苯甲酰甲酸甲酯特异性转化成(r)-邻氯扁桃酸甲酯，使用10g/l该酶的基因工程冻干细胞即可对底物浓度为200g/l的邻氯苯甲酰甲酸甲酯进行高效转化，且转化率超过99％，产物光学纯度超过99％，将还原酶应用到(r)-邻氯扁桃酸甲酯合成中能够显著提高生产效率，降低生产成本。
2、本专利技术的具体技术方案为：
3、一种生物催化不对称反应还原酶，生物催化不对称反应还原酶为羰基还原酶，其氨基酸序列如seq id no.2所示，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
4、作为优选，所述生物催化不对称反应还原酶的氨基酸序列是由野生型生物催化不对称反应还原酶氨基酸序列经过第125位苏氨酸突变为缬氨酸，第193位酪氨酸突变成丙氨酸，第233位亮氨酸突变为苯丙氨酸制得，所述野生型生物催化不对称反应还原酶氨基酸序列如seq id no.1所示。
5、作为优选，所述野生型生物催化不对称反应还原酶氨基酸序列来源于公开号cn116814572a公开的茶假丝酵母菌candida theae的遗传资源。
6、作为优选，所述遗传资源为野生型生物催化不对称反应还原酶核苷酸序列，所述野生型生物催化不对称反应还原酶核苷酸序列如seq id no.4所示。
7、本专利技术提供了一种生物催化不对称反应还原酶，该还原酶对邻氯苯甲酰甲酸甲酯具有高反应活性和高(r)-选择性，该还原酶能够和葡萄糖脱氢酶偶联催化反应底物邻氯苯甲酰甲酸甲酯特异性转化成(r)-邻氯扁桃酸甲酯，使用6～10g/l该酶的基因工程冻干细胞即可对底物浓度为150～200g/l邻氯苯甲酰甲酸甲酯进行高效转化，且转化率超过99％，产物光学纯度超过99％，催化邻氯苯甲酰甲酸甲酯的酶活性显著高于生物催化不对称反应还原酶野生型菌体。
8、一种重组载体，含有上述的生物催化不对称反应还原酶的核苷酸序列和葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列；所述葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列如seq id no.5所示。
9、作为优选，所述载体为质粒、噬菌体或病毒载体。
10、一种基因工程菌，包含上述的重组载体。
11、作为优选，所述重组载体为pacycduet-1。
12、作为优选，所述基因工程的载体为大肠杆菌。
13、一种生物催化不对称反应还原酶在制备(r)-邻氯扁桃酸甲酯中的应用，以邻氯苯甲酰甲酸甲酯为反应底物，将上述的生物催化不对称反应还原酶和葡萄糖置于反应溶液中制得反应体系，反应体系反应制得(r)-邻氯扁桃酸甲酯。
14、作为优选，所述反应溶液为缓冲溶液、葡萄糖和有机溶剂的混合液，所述缓冲溶液为tris-hcl缓冲液或磷酸钠缓冲液，缓冲溶液的浓度范围为10至200mm，ph为7.5～8.0；所述葡萄糖初始浓度为底物初始浓度的0.9～1.1倍；
15、作为优选，所述有机溶剂为乙醇、异丙醇、甲醇中的一种或多种，缓冲液与有机溶剂的体积比为900～950：50～100。
16、作为优选，所述反应体系中底物的初始浓度为150～220g/l，生物催化不对称反应还原酶和葡萄糖脱氢酶上述的基因工程菌诱导表达后的菌体形式加入，生物催化不对称反应还原酶的添加量以冻干细胞计为6～10g/l，葡萄糖脱氢酶的添加量以冻干细胞计为1～5g/l。
17、与现有技术相比，本申请具有以下技术效果：
18、本专利技术提供了一种生物催化不对称反应还原酶，该还原酶对邻氯苯甲酰甲酸甲酯具有高反应活性和高r-选择性，该还原酶能够和葡萄糖脱氢酶对反应底物邻氯苯甲酰甲酸甲酯进行特异性转化(r)-邻氯扁桃酸甲酯，使用6～10g/l的冻干细胞就能够高效催化150～200g/l的邻氯苯甲酰甲酸甲酯，且转化率超过99％，ee值超过99％，本专利技术提供的生物催化不对称反应还原酶催化单位底物量时生物催化不对称反应还原酶的使用量更低，本专利技术提供的生物催化不对称反应还原酶具有更高的酶活性且无需外源添加辅酶；应用到工业生产中能够显著提高生产效率，降低生产成本。
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1.一种生物催化不对称反应还原酶，其特征是，生物催化不对称反应还原酶为羰基还原酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的生物催化不对称反应还原酶，其特征是，所述生物催化不对称反应还原酶的氨基酸序列是由野生型生物催化不对称反应还原酶氨基酸序列经过第125位苏氨酸突变为缬氨酸，第193位酪氨酸突变成丙氨酸，第233位亮氨酸突变为苯丙氨酸制得，所述野生型生物催化不对称反应还原酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的生物催化不对称反应还原酶，其特征是，所述野生型生物催化不对称反应还原酶氨基酸序列来源于茶假丝酵母菌Candida theae的遗传资源。
4.根据权利要求3所述的生物催化不对称反应还原酶，其特征是，所述遗传资源为野生型生物催化不对称反应还原酶核苷酸序列，所述野生型生物催化不对称反应还原酶核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.一种重组载体，其特征是，含有权利要求1中所述的生物催化不对称反应还原酶的核苷酸序列和葡萄糖脱氢酶的核
6.一种基因工程菌，其特征是，包含权利要求5所述的重组载体。
7.一种生物催化不对称反应还原酶在制备（R）-邻氯扁桃酸甲酯中的应用，其特征是，以邻氯苯甲酰甲酸甲酯为反应底物，使用权利要求1所述的生物催化不对称反应还原酶和葡萄糖脱氢酶置于反应溶液中制得反应体系，反应体系反应制得（R）-邻氯扁桃酸甲酯。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述反应溶液为缓冲溶液、葡萄糖和有机溶剂的混合液，所述缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液或磷酸钠缓冲液，缓冲溶液的浓度范围为10~200 mM，pH为7.5~8.0；所述葡萄糖初始浓度为底物初始浓度的0.9~1.1倍。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征是，所述有机溶剂为乙醇、异丙醇、甲醇中的一种或多种，缓冲液与有机溶剂的体积比为900~950：50~100。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述反应体系中底物的初始浓度为150~220g/L，生物催化不对称反应还原酶和葡萄糖脱氢酶以权利要求6所述的基因工程菌诱导表达后的菌体形式加入，生物催化不对称反应还原酶的添加量以冻干细胞计为6~10g/L, 葡萄糖脱氢酶的添加量以冻干细胞计为1~5g/L。
...【技术特征摘要】
1.一种生物催化不对称反应还原酶，其特征是，生物催化不对称反应还原酶为羰基还原酶，其氨基酸序列如seq id no.2所示，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
2.根据权利要求1所述的生物催化不对称反应还原酶，其特征是，所述生物催化不对称反应还原酶的氨基酸序列是由野生型生物催化不对称反应还原酶氨基酸序列经过第125位苏氨酸突变为缬氨酸，第193位酪氨酸突变成丙氨酸，第233位亮氨酸突变为苯丙氨酸制得，所述野生型生物催化不对称反应还原酶氨基酸序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求2所述的生物催化不对称反应还原酶，其特征是，所述野生型生物催化不对称反应还原酶氨基酸序列来源于茶假丝酵母菌candida theae的遗传资源。
4.根据权利要求3所述的生物催化不对称反应还原酶，其特征是，所述遗传资源为野生型生物催化不对称反应还原酶核苷酸序列，所述野生型生物催化不对称反应还原酶核苷酸序列如seq id no.4所示。
5.一种重组载体，其特征是，含有权利要求1中所述的生物催化不对称反应还原酶的核苷酸序列和葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列；所述葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列如seq id no.5所示。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：顾佳黎，施毅荣，肖莉，王亚军，李永进，
申请(专利权)人：湖州师范学院，
类型：发明
国别省市：
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