【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、nk细胞已被公认为一种有前景的抗癌的细胞疗法，部分原因是其强大的细胞毒性、更好的安全性以及作为现成疗法的潜力。作为先天免疫系统的一部分的nk细胞是第一反应者，具有识别和直接杀伤癌细胞的固有能力。与t细胞不同，nk细胞以mhc和抗原独立的方式杀伤癌细胞。nk细胞表达一组编码种系的活化性受体和抑制性受体，这些受体与其配体结合，并且这些抑制性受体和活化性受体的信号传导的平衡控制着nk细胞的活性。活化性受体在与通常在恶性细胞和病毒感染细胞中表达的配体结合后活化nk细胞，抑制性受体在与通常在健康细胞上表达的配体(诸如mhc分子)结合后防止nk细胞功能。nk细胞的活化和靶细胞的杀伤取决于对这些活化性信号和抑制性信号的微调。重要的是，nk细胞表达fcγr cd16活化性受体，这些受体与靶向肿瘤抗原的抗体的fc区结合，并能够以抗体依赖性细胞毒性(adcc)方式杀伤癌细胞。癌细胞上调抑制性受体的配体，并且这些配体与抑制性受体的结合可防止nk细胞的抗肿瘤活性并促进其耗竭。在各种癌症中，抑制性受体表达的上调与nk细胞的耗竭表型相关，包括抗癌细胞的细胞毒性降低和促炎细胞因子ifnγ的表达减少。
2、nk细胞不仅直接杀伤肿瘤细胞，而且还通过分泌促炎细胞因子和趋化因子来募集、协调和活化包括适应性免疫系统细胞在内的其他免疫细胞。最近的研究表明nk细胞在许多免疫疗法的功效中发挥着重要作用。此外，nk细胞可高效扩增、有效冷冻保存而不会损失功效，并且与移植物抗宿主病(gvhd)无关，从而支持将冷冻保存的供体来源材料作为现成细胞疗法的潜在
3、具有免疫球蛋白和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)是nk细胞和t细胞的主要抑制性受体。tigit与抑制性受体cd96(tactile)、pvrig、活化性受体cd226(dnam-1)竞争，以便与通常在癌细胞和抗原呈递细胞(apc)上表达的配体cd155(pvr)和cd112(nectin-2或pvrl2)结合，以及与pvrl4(即nectin4，其为tigit的一种新型独特配体，几乎只在肿瘤细胞上表达)结合。tigit信号传导通过多个步骤调节肿瘤免疫周期。它能够防止t细胞增殖、细胞毒性以及这些细胞产生促炎细胞因子ifnγ。先前的研究报告称，tigit在癌症中的t细胞和nk细胞两者中都出现上调，并且通常与这两种细胞的耗竭相关。在小鼠模型中，阻断tigit可恢复nk细胞的细胞毒性，增加ifnγ和tnfα的表达，并促进肿瘤特异性t细胞免疫。此外，tigit和pd-1联合阻断具有协同作用，可改善临床前小鼠模型和早期临床试验中的肿瘤控制和存活。在b16小鼠模型中，pd-1和tigit阻断的治疗功效取决于nk细胞的存在，因为nk细胞耗竭会消除这种功效。在i期、ii期和iii期临床试验中对单独使用或与其他检查点抑制剂(特别是抗pd-1)组合使用的几种抗tigit抗体进行测试。尽管ii期试验显示这种组合可提高nsclc的无进展生存期(pfs)和总生存期(os)，但iii期skyscraper-01并未达到其pfs的共同主要终点，同时该研究还不足以评估os。目前对tigit调节免疫细胞功能的大部分了解都是基于t细胞和/或来自小鼠模型；而目前对人nk细胞中tigit的体外机制研究十分有限，并且主要依赖于nk细胞系。目前对tigit阻断在功能和/或分子水平上对人nk细胞抗肿瘤功能的影响都缺乏了解，而这种了解在解决该疗法的潜在缺点以及评估过继性nk细胞和抗tigit抗体的组合治疗潜力时是需要的。
技术实现思路
1、在一些方面，本文公开了一种ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)的表达受到抑制的工程化nk细胞。tigit的表达可通过tigit基因或其片段的缺失而受到抑制。在一些实施方案中，其中使用包括将具有crispr/cas向导rna的crispr/cas核酸内切酶(cas)9系统引入nk细胞的方法来抑制tigit的表达，其中该向导rna靶向tigit基因或其片段。在一些方面，tigit的表达受到靶向tigit多核苷酸的sirna或shrna的抑制。在一些方面，本文公开的任何前述方面的nk细胞是原代nk细胞或nk细胞系。本文还公开了任何前述方面的nk细胞，其中该nk细胞是扩增的nk细胞或未扩增的nk细胞。在一些方面，nk细胞可在体外/体内暴露于nk细胞扩增组合物(例如饲养细胞、工程化pm颗粒或外来体)。在一些方面，任何前述方面的饲养细胞或工程化颗粒包含与它们的外表面结合的fc结构域。在一些实施方案中，nk细胞扩增组合物还包含nk细胞效应剂(包括例如il-21和/或41bbl)。
2、本文公开的工程化nk细胞显示出增强的抗癌症或感染性疾病的功能。因此，本文公开了治疗、减轻、抑制、减少、改善和/或预防受试者的癌症、转移性病灶或感染性疾病的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的任何前述方面的工程化nk细胞。类似地，本公开提供了治疗有效量的任何前述方面的工程化nk细胞，以用于治疗、减轻、抑制、减少、改善和/或预防受试者的癌症、转移性病灶或感染性疾病。在一些方面，在向受试者施用工程化nk细胞之前，可将工程化nk细胞与tigit抑制剂一起孵育。在一些方面，该方法还包括向受试者施用治疗有效量的tigit抑制剂和/或治疗有效量的检查点阻断剂(例如，pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂、pd-l2抑制剂或ctla-4抑制剂)。
3、nk细胞耗竭发生在患有癌症或某些感染性疾病的受试者身上。本文公开的工程化nk细胞显示出增强的功能(包括例如增强的细胞毒性功能和/或增加的ifnγ、tnfα和/或cd107a的表达)。因此，本文公开了用于再活化nk细胞、逆转nk细胞耗竭以及/或者增强nk细胞功能的方法，其中所述方法包括抑制nk细胞的tigit表达，或者将nk细胞与tigit抑制剂一起孵育。
4、本文还公开了任何前述方面的用于再活化nk细胞、逆转nk细胞耗竭以及/或者增强nk细胞功能的方法，和/或任何前述方面的治疗、减轻、抑制、减少、改善和/或预防癌症和/或转移性病灶的方法，其中癌症选自血液癌、淋巴瘤、结直肠癌、结直肠癌、肺癌、头颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肾癌、皮肤癌、宫颈癌、胰腺癌和乳腺癌。在一个方面，癌症包括实体瘤。在一些方面，癌症选自急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、骨髓纤维化、多发性骨髓瘤。在另一个方面，癌症选自白血病、淋巴瘤、肉瘤、癌，并且可源自骨髓、脑、肺、乳腺、胰腺、肝、头颈、皮肤、生殖道、前列腺、结肠、肝、肾、腹膜、骨、关节本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)的表达受到抑制的工程化NK细胞。
2.根据权利要求1所述的工程化NK细胞，其中TIGIT的所述表达通过TIGIT基因或其片段的缺失而受到抑制。
3.根据权利要求1或2所述的工程化NK细胞，其中使用包括将具有CRISPR/Cas向导RNA的CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas)9系统引入所述NK细胞的方法来抑制TIGIT的所述表达，其中所述向导RNA靶向所述TIGIT基因或其片段。
4.根据权利要求1所述的工程化NK细胞，其中TIGIT的所述表达受到靶向TIGIT多核苷酸的siRNA或shRNA的抑制。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞的抑制性受体的表达受到抑制，所述抑制性受体选自包含脊髓灰质炎病毒受体相关的免疫球蛋白结构域(PVRIG)、CD96、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、TIM-3、NKG2A、PD-1和CTLA-4。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的工程化NK细胞，其中所述NK细胞是原代NK细胞或NK细胞系
7.根据权利要求1至6中任一项所述的工程化NK细胞，其中所述NK细胞是扩增的NK细胞或未扩增的NK细胞。
8.根据权利要求7所述的工程化NK细胞，其中所述扩增的NK细胞在体外或离体暴露于NK细胞扩增组合物。
9.根据权利要求8所述的工程化NK细胞，其中所述NK细胞扩增组合物包含饲养细胞、工程化PM颗粒或外来体。
10.根据权利要求9所述的工程化NK细胞，其中所述饲养细胞或工程化颗粒包含与它们的外表面结合的Fc结构域。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的工程化NK细胞，其中所述NK细胞扩增组合物还包含NK细胞效应剂。
12.根据权利要求11所述的工程化NK细胞，其中所述NK细胞效应剂包含IL-21和/或41BBL。
13.一种治疗、减轻、抑制、减少、改善和/或预防受试者的癌症、转移性病灶或感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至12中任一项所述的工程化NK细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的TIGIT抑制剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述TIGIT抑制剂是抗TIGIT抗体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗TIGIT抗体包含与Fc受体结合的可结晶区域片段(Fc区)。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗TIGIT抗体缺乏Fc区，或包含相对于参考对照具有降低的对Fc受体的亲和力的Fc区。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的检查点阻断剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述检查点阻断剂包括PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD-L2抑制剂或CTLA-4抑制剂。
20.一种治疗、减轻、抑制、减少、改善和/或预防受试者的癌症、转移性病灶或感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞的Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)的表达受到抑制。
21.根据权利要求20所述的方法，其中TIGIT的所述表达通过TIGIT基因或其片段的缺失而受到抑制。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中使用包括将具有CRISPR/Cas向导RNA的CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas)9系统引入所述NK细胞的方法来抑制TIGIT的所述表达，其中所述向导RNA靶向所述TIGIT基因或其片段。
23.根据权利要求22所述的方法，其中TIGIT的所述表达受到靶向TIGIT多核苷酸的siRNA或shRNA的抑制。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述工程化NK细胞的抑制性受体的表达受到抑制，所述抑制性受体选自包含脊髓灰质炎病毒受体相关的免疫球蛋白结构域(PVRIG)、CD96、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、TIM-3、NKG2A、PD-1和CTLA-4。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，其中所述NK细胞是原代NK细胞或NK细胞系。
26.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所述NK细胞是扩增的NK细胞或未扩增的NK细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述扩增的NK细胞在体外或离体暴露于NK细胞扩增组合物。
28.根据权利要...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)的表达受到抑制的工程化nk细胞。
2.根据权利要求1所述的工程化nk细胞，其中tigit的所述表达通过tigit基因或其片段的缺失而受到抑制。
3.根据权利要求1或2所述的工程化nk细胞，其中使用包括将具有crispr/cas向导rna的crispr/cas核酸内切酶(cas)9系统引入所述nk细胞的方法来抑制tigit的所述表达，其中所述向导rna靶向所述tigit基因或其片段。
4.根据权利要求1所述的工程化nk细胞，其中tigit的所述表达受到靶向tigit多核苷酸的sirna或shrna的抑制。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化nk细胞，其中所述工程化nk细胞的抑制性受体的表达受到抑制，所述抑制性受体选自包含脊髓灰质炎病毒受体相关的免疫球蛋白结构域(pvrig)、cd96、淋巴细胞活化基因3(lag3)、tim-3、nkg2a、pd-1和ctla-4。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的工程化nk细胞，其中所述nk细胞是原代nk细胞或nk细胞系。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的工程化nk细胞，其中所述nk细胞是扩增的nk细胞或未扩增的nk细胞。
8.根据权利要求7所述的工程化nk细胞，其中所述扩增的nk细胞在体外或离体暴露于nk细胞扩增组合物。
9.根据权利要求8所述的工程化nk细胞，其中所述nk细胞扩增组合物包含饲养细胞、工程化pm颗粒或外来体。
10.根据权利要求9所述的工程化nk细胞，其中所述饲养细胞或工程化颗粒包含与它们的外表面结合的fc结构域。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的工程化nk细胞，其中所述nk细胞扩增组合物还包含nk细胞效应剂。
12.根据权利要求11所述的工程化nk细胞，其中所述nk细胞效应剂包含il-21和/或41bbl。
13.一种治疗、减轻、抑制、减少、改善和/或预防受试者的癌症、转移性病灶或感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至12中任一项所述的工程化nk细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的tigit抑制剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述tigit抑制剂是抗tigit抗体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗tigit抗体包含与fc受体结合的可结晶区域片段(fc区)。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗tigit抗体缺乏fc区，或包含相对于参考对照具有降低的对fc受体的亲和力的fc区。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的检查点阻断剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述检查点阻断剂包括pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂、pd-l2抑制剂或ctla-4抑制剂。
20.一种治疗、减轻、抑制、减少、改善和/或预防受试者的癌症、转移性病灶或感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的工程化nk细胞，其中所述工程化nk细胞的ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)的表达受到抑制。
21.根据权利要求20所述的方法，其中tigit的所述表达通过tigit基因或其片段的缺失而受到抑制。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中使用包括将具有crispr/cas向导rna的crispr/cas核酸内切酶(cas)9系统引入所述nk细胞的方法来抑制tigit的所述表达，其中所述向导rna靶向所述tigit基因或其片段。
23.根据权利要求22所述的方法，其中tigit的所述表达受到靶向tigit多核苷酸的sirna或shrna的抑制。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述工程化nk细胞的抑制性受体的表达受到抑制，所述抑制性受体选自包含脊髓灰质炎病毒受体相关的免疫球蛋白结构域(pvrig)、cd96、淋巴细胞活化基因3(lag3)、tim-3、nkg2a、pd-1和ctla-4。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，其中所述nk细胞是原代nk细胞或nk细胞系。
26.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所述nk细胞是扩增的nk细胞或未扩增的nk细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述扩增的nk细胞在体外或离体暴露于nk细胞扩增组合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述nk细胞扩增组合物包含饲养细胞、工程化pm颗粒或外来体。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述饲养细胞或工程化颗粒包含与它们的外表面结合的fc结构域。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中所述nk细胞扩增组合物还包含nk细胞效应剂。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述nk细胞效应剂包含il-21和/或41bbl。
32.根据权利要求20至31中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的tigit抑制剂。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述tigit抑制剂是抗tigit抗体。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述抗tigit抗体包含与fc受体结合的可结晶区域片段(fc区)。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗tigit抗体缺乏fc区，或包含相对于参考对照具有降低的对fc受体的亲和力的fc区。
36.根据权利要求20至35中任一项所述的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的检查点阻断剂。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述检查点阻断剂包括pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂、pd-l2抑制剂或ctla-4抑制剂。
38.一种用于再活化nk细胞、逆转nk细胞耗竭以及/或者增强nk细胞功能的体外或离体方法，所述方法包括抑制所述nk细胞的ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)的表达，或者将所述nk细胞与tigit抑制剂一起孵育。
39.根据权利要求38所述的方法，其中tigit的所述表达通过tigit基因或其片段的缺失而受到抑制。
40.根据权利要求38或39所述的方法，其中使用包括将具有crispr/cas向导rna的crispr/cas核酸内切酶(cas)9系统引入所述nk细胞的方法来抑制tigit的所述表达，其中所述向导rna靶向所述tigit基因或其片段。
41.根据权利要求40所述的方法，其中tigit的所述表达受到靶向tigit多核苷酸的sirna或shrna的抑制。
42.根据权利要求3838至4141中任一项所述的方法，其中所述工程化nk细胞的抑制性受体的表达受到抑制，所述抑制性受体选自包含脊髓灰质炎病毒受体相关的免疫球蛋白结构域(p...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·J·科皮克，M·F·汉森，T·克鲁姆佩雷斯，
申请(专利权)人：弗罗里达中央大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：
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