【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，特别是涉及一种双特异性抗体、编码基因及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
技术介绍
1、癌症是导致死亡的主要原因，全球每年有近 1000 万人死于癌症。其中，肝细胞癌（hcc）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，也是全球癌症死亡的第三大原因，发病率呈逐年上升趋势。由于肝细胞癌起病隐匿，难以早期诊断，大多数患者在确诊时已处于晚期或转移期（如肝外扩散或大血管侵袭），其预后通常较差，生存期短，死亡率高。对于晚期肝细胞癌患者以及经过局部治疗后复发的中期hcc患者，全身治疗是改善生存期的首选治疗方案。
2、自2007年sharp试验首次展示了索拉非尼在不可切除hcc中改善总生存期的效果以来，它成为了fda批准的首个用于晚期肝癌患者的一线治疗选择。随着imbrave150试验结果的公布，以酪氨酸激酶抑制剂（tkis）为主的靶向治疗已经成为晚期肝癌的一线标准护理。尽管在此期间涌现了多种靶向药物，fda已加速或完全批准了多种晚期hcc的一线或二线治疗方案，但患者的总生存期仍然有待提高，迫切需要探索新的有效治疗方式。2017年至今，多个针对晚期hcc一线或二线全身治疗的iii期临床试验呈现了积极的结果。基于checkmate-040和keynote-224研究结果，fda有条件的批准了pd-1单抗nivolumab和pembrolizumab作为肝癌的二线治疗。在长达十多年以酪氨酸激酶抑制剂主导的晚期肝癌治疗后，基于免疫检查点抑制剂（ici）的治疗方案已成为晚期肝癌全身治疗的主要组成部分，扩大了晚期hcc患者的治疗选
3、imbrave150研究展示了atezolizumab联合bevacizumab在晚期hcc患者中的显著生存获益，使其于2020年获得了fda批准作为不可切除hcc的一线全身治疗。在最新的生存分析中，atezolizumab联合bevacizumab的中位总生存期相比于索拉非尼为19.2个月对比13.4个月（p < 0.001），患者获得了显著的生存优势。此外，基于ici的晚期hcc一线全身治疗联合方案还包括durvalumab + tremelimumab双免疫检查点治疗。在himalaya iii期临床试验中，未接受全身治疗的晚期hcc患者接受durvalumab加tremelimumab的中位总生存期为16.4个月，而接受索拉非尼治疗的为13.8个月，表明该方案优于索拉非尼。目前，正在积极进行基于ici的全身治疗方案的多个iii期临床试验，如orient-32、leap-002和shr-1210-iii-310等，然而目前的联合治疗策略仍然存在局限性，免疫检查点抑制剂（icis）联合tki/贝伐珠单抗等的不同治疗策略下，客观有效率（orr）不到50%，中位生存时间（mos）不到2年，且3-4级以上不良反应发生率高达30-90%，迫切需要新的治疗策略去增加免疫治疗的疗效，同时降低不良反应发生率。
4、肿瘤靶点的选择是决定双特异性抗体治疗疗效的关键因素，所选择的肿瘤特异性抗原需在肿瘤组织高表达而在重要组织不表达或表达水平极低。
5、双特异性抗体（bsabs）是一类能够同时识别两种不同抗原或表位的蛋白质家族。随着药物研发和技术平台的不断进步，近年来bsabs作为抗肿瘤免疫治疗的新策略受到了广泛关注。随着先进技术的发展，目前已经提出了多种bsab构建形式。根据fc结构域的不同，bsab大致可分为两种类型：igg格式和非igg格式。不含fc的bsabs包括tandab、tandscfv、dart、diabody、f（ab'）2和immtac等。而含有fc结构域的igg样抗体分子则保留了fc介导的效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（adcc）、补体依赖性细胞毒性作用（cdc）和抗体依赖性细胞吞噬作用（adcp）。尽管目前双特异性抗体的结构形式层出不穷，但bite和triomabs是目前各种bsab分子中研发较为成熟的形式之一。bite是由通过短肽接头连接的单链可变片段（scfv）组成的融合蛋白，可以同时靶向两个不同的靶点，通常通过募集t细胞介导对肿瘤细胞的杀伤。2014年，blinatumomab成为首个获得fda批准用于治疗复发/难治性b前体急性淋巴细胞白血病（all）的抗cd19/cd3的bite分子，并在不同类型的血液肿瘤中相继获批。blinatumomab双特异性抗体的成功推动了双特异性抗体免疫疗法在实体肿瘤中的发展。triomabs是另一种抗体构建形式，作为一种igg样分子，相较于bite分子具有较长的血清清除半衰期。它可以通过fc段结构域与先天免疫细胞的fcr相互作用，从而介导对免疫细胞的募集和对t细胞的活化增殖，通过联合先天免疫反应和适应性免疫反应的杀伤机制产生有效的抗肿瘤效应。目前尚未有关于通过靶向gpc3/pd-l1双特异性抗体进行肝癌免疫治疗的相关报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种双特异性抗体、编码基因及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种双特异性抗体，所述双特异性抗体为靶向gpc3/pd-l1的双特异性抗体。
4、优选的是，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
5、本专利技术还提供编码所述双特异性抗体的dna分子，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
6、本专利技术还提供所述双特异性抗体的表达载体，所述表达载体以cmv作为启动子，在该cmv启动子的下游依次连接igκ分泌肽编码基因、gpc3单链可变区片段gpc3-scfv、hinge、fc、p2a、igκ分泌肽编码基因、pd-l1单链可变区片段pd-l1-scfv、hinge和fc。
7、本专利技术还提供所述表达载体的构建方法，包括以下步骤：
8、（1）根据gpc3的轻重链序列、pd-l1的轻重链序列及fc片段，通过重叠pcr分别扩增出gpc3-scfv-fc片段和pd-l1-scfv-fc片段，克隆位点分别为 hind iii/ ecor i、 ecor i/ xho i；
9、（2）gpc3轻重链序列和pd-l1轻重链序列之间通过(g4s)3进行连接，扩增出的gpc3-scfv和pd-l1-scfv通过hinge与fc段进行连接；
10、（3）在引物设计过程中引入p2a剪切肽，并采用双酶切法将目的序列片段和载体双酶切出粘性末端后进行双特异性抗体质粒的构建，启动子为cmv。
11、本专利技术还提供所述双特异性抗体、所述dna分子或所述表达载体在制备治疗肝癌的药物中的应用。
12、本专利技术还提供一种用于治疗肝癌的基因药物，包括所述双特异性抗体、所述dna分子本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体为靶向GPC3/PD-L1的双特异性抗体；其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码如权利要求1所述双特异性抗体的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
3.如权利要求1所述双特异性抗体的表达载体，其特征在于，所述表达载体以CMV作为启动子，在该CMV启动子的下游依次连接Igκ分泌肽编码基因、GPC3单链可变区片段GPC3-scFv、Hinge、Fc、P2A、Igκ分泌肽编码基因、PD-L1单链可变区片段PD-L1-scFv、Hinge和Fc。
4.如权利要求3所述表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.如权利要求1所述双特异性抗体、权利要求2所述DNA分子或权利要求3所述表达载体在制备治疗肝癌的药物中的应用。
6.一种用于治疗肝癌的基因药物，其特征在于，包括权利要求1所述双特异性抗体、权利要求2所述DNA分子或权利要求3所述表达载体。
7.一种用于治疗肝癌的药物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述双特异性抗体、
8.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，可药用载体适用于液体剂型、固体剂型或膏体剂型。
...【技术特征摘要】
1.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体为靶向gpc3/pd-l1的双特异性抗体；其氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.编码如权利要求1所述双特异性抗体的dna分子，其特征在于，其核苷酸序列如seqid no.2所示。
3.如权利要求1所述双特异性抗体的表达载体，其特征在于，所述表达载体以cmv作为启动子，在该cmv启动子的下游依次连接igκ分泌肽编码基因、gpc3单链可变区片段gpc3-scfv、hinge、fc、p2a、igκ分泌肽编码基因、pd-l1单链可变区片段pd-l1-scfv、hinge和fc。
4.如权利要求3所述表...
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