一种长效蛋白质药物及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种制备长效蛋白质药物及其制备方法，属于生物技术领域。具体地讲，本发明专利技术是通过对蛋白质药物进行改造，使之具有结合抗体Ｆｃ段的活性。改造后的蛋白质药物在血液中能够结合抗体的Ｆｃ段，从而与抗体形成大分子复合体，提高其体内的半衰期。由于半衰期的延长，改造后的蛋白质药物具有更持久的体内活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
具体地讲，本专利技术公布了一种制备长效蛋白质药物的方法， 利用该方法可以对药物蛋白质进行改造，提高其体内的半衰期，延长其体内疗效。
技术介绍
重组蛋白质药物是目前最主要的一类生物技术药物，与小分子化学药物相比，重组蛋白 质药物具有特异性强、副作用小、疗效好等优点，但是蛋白质类药物的缺点也是显而易见的。 蛋白质药物易失活、给药途径单一、体内的半衰期短，对于外源性蛋白质药物，还存在抗原 性的问题。作为生物大分子，每种蛋白质都有其独特的高级结构，蛋白质药物的活性依赖于 其正确的高级结构，任何影响其高级结构的理化因素都可能导致蛋白质药物活性的降低或丧 失，因此，蛋白质药物对存储条件要求较高， 一般为4'C或低温保存。在使用方面，蛋白质药 物还存在着给药途径少、半衰期短等缺点。蛋白质药物一般不能通过口服给药，只能通过皮 下或静脉注射给药，通过皮下或静脉注射而进入体内的蛋白质药物不可避免地会受到体内蛋 白酶的攻击而降解，从而失去活性。另外，作为药物的蛋白质一般分子量相对较小，容易被 肾小球滤过，导致血液中有效药物浓度降低。正是由于这些原因，使得蛋白质药物的体内半 衰期较短，刚给药后，蛋白质药物浓度一过性增高，之后很快降低到有效浓度以下，临床上 为了使血液中蛋白质药物浓度达到有效治疗浓度，必须反复给药，从而导致用药成本增加、 副作用增大、病人的依从性差等问题。为了提高蛋白质药物的生物利用度和疗效，临床上急 需稳定、长效的蛋白质药物。目前提高蛋白质药物的半衰期和疗效的途径主要有构建更稳定的突变体蛋白、聚乙二醇 修饰和与血清白蛋白融合等。聚乙二醇修饰的蛋白质药物具有很多优点，主要有蛋白质药物 的分子量增加，被肾小球过滤的几率减小，在体内的半衰期延长；由于聚乙二醇的屏蔽作用 使蛋白质免疫原性降低，被蛋白酶降解的几率减小；聚乙二醇化的水解使得蛋白质药物活性 得到恢复，起到类似缓释的作用，从而长时间维持有效的血药浓度。但是蛋白质药物的聚乙 二醇修饰也存在着明显的不足，主要是聚乙二醇的使用导致生产成本增加，聚乙二醇的屏蔽 作用导致蛋白质的活性降低，聚乙二醇修饰的不均一性导致产品质控困难，回收率低，进一 步增加了生产成本。因此，有必要开发新的长效蛋白质药物制备方法。本专利技术的目的就是建 立一种新的长效蛋白质药物制备方法，可以对蛋白质药物进行长效改造。
技术实现思路
本专利技术公开了一种长效蛋白质药物制备方法，该方法的特点是将具有抗体Fc段结合活性 的小肽(或蛋白质)与药物蛋白质相连接，从而使药物蛋白质在体内具有抗体Fc段结合活性， 改造后的药物蛋白质在体内能够与抗体的Fc段结合，形成大分子复合体，从而增加其半衰期， 维持更持久的体内活性。这种连接了具有抗体Fc段结合活性的小肽(或蛋白质)的药物蛋白 质就是一种长效蛋白质药物。将具有抗体Fc段结合活性的小肽(或蛋白质)与药物蛋白质相连接可以采取生物学方法，也可以采取化学偶联法。生物学方法的步骤包括构建药物蛋白质和具有抗体FC段结合活性的小肽(或蛋白质) 的融合基因，将融合基因通过酶切、连接方法，或同源重组等方法克隆到表达载体中。用构 建好的融合基因表达载体转化宿主细胞，通过宿主细胞表达融合蛋白并进行分离纯化。该融合蛋白即为长效蛋白质药物。其中，融合基因的构建可以采用SOE(Gene splicing by over lap extension)法，也可以采用SDL(Gene splicing by directed ligation)法或PCR法。SOE法构建融合基因实际上是通过复制时DNA链的交错延伸实现基因拼接的，基本步 骤为1、 为药物蛋白质基因(基因I )设计上、下游引物primed和primer2，为具有抗体Fe 段结合活性的小肽或蛋白质基因(基因II)设计上、下游primer3和primer4，其中primerl 和primer4为常规引物，而primer2的3'端序列为基因I常规引物，其5'端序列则为基因II正 义链5'末端互补序列。同理，primer3的3'端序列为基因II的常规引物，其5'端序列则为基 因I反义链5'末端互补序列。2、 将基因I、 II分别进行PCR扩增，产物分别为基因I的正义链A、反义链B，基因II 的正义链C、反义链D。3、 将两种PCR产物混合，经变性及退火处理，A链和D链部分碱基互补配对形成杂交链。4、 在DNA聚合酶I作用下，A和D链互为引物和模板，合成出包含基因I和基因II的 融合基因。SDL法构建融合基因的基本步骤为1、 为药物蛋白质基因(基因I )设计上、下游引物primerl和primer2，为具有抗体Fc 段结合活性的小肽或蛋白质基因(基因n)设计上、下游primer3和primer4，其中primerl 和primer4为常规引物，而primer2的3'端序列为基因I常规引物，5'端序列则包含一种限制 性内切酶A的酶切位点；同理，primer3的3'端序列为基因II的常规引物，5'端序列则包含 一种限制性内切酶B的酶切位点。而限制性内切酶A和B切割靶序列后形成的粘性末端应互 补。2、 将基因I、 II分别进行PCR扩增，回收扩增产物。将基因I扩增产物用限制性内切酶 A酶切，将基因II扩增产物用限制性内切酶B酶切。3、 将酶切后的两种基因纯化、回收，然后在DNA连接酶的作用下将基因I和基因II通 过其互补的粘性末端相连接，形成融合基因。PCR方法构建融合基因通过PCR构建融合基因的方法主要适用于将药物蛋白质基因与小肽基因融合。由于小肽 基因小，可以将小肽基因序列设计到PCR引物中。通过PCR扩增药物蛋白质基因时，小肽 基因就被融合到药物蛋白质基因的上游或下游，从而得到药物蛋白质与小肽的融合基因。将具有抗体Fc段结合活性的小肽(或蛋白质)与药物蛋白质相连接的另外一种方法就是化学偶联法。其基本步骤为将^W白J^和具有抗体，C殺结合活性的小肽(或蛋白质)按 照一定的比例(摩尔比为l: 1~1: 20)振荡混匀，边搅拌边逐滴加入偶联剂。加毕，再搅拌 5 10min，然后在室温下继续反应2 3h。之后，采用层析技术将偶联了小肽的药物蛋白质 和未偶联小肽的药物蛋白质分开，偶联了小肽的药物蛋白质即为长效蛋白质药物。利用化学偶联法制备长效蛋白质药物时，应根据具有抗体Fc段结合活性的小肽(或蛋白 质)的性质选用不同的偶联剂。常用作偶联剂的有碳化二亚胺类、戊二醛、二异氰酸化合物 和二卤化二硝基苯等。这些偶联剂使具有抗体Fc段结合活性的小肽(或蛋白质)与药物蛋白 质在-COOH、 -\112或-811等基团部位发生结合。在本专利技术的实施例中，提供了一种通过生物学方法制备长效人粒细胞集落刺激因子的步 骤，具体包括采用两步PCR方法构建hG-CSF与小肽VETWKTSRISIF的融合基因，将该 融合基因用五coR I和5a附H I双酶切后连接到pBV220表达载体中，转化大肠杆菌DH5a， 选取序列正确的克隆诱导表达hG-CSF-小肽融合蛋白，采用阴离子交换柱和分子筛层析等纯 化方法将hG-CSF-小肽融合蛋白进行纯化。用本方法制备的长效人粒细胞集落剌激因子保留了原有生物学活性，作用时间明显延长， 可有效避免聚乙二醇修饰带来的生产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种长效蛋白质药物，其特征为在药物蛋白质上连有一段小肽（或蛋白质），该段小肽（或蛋白质）具有抗体Ｆｃ段结合活性。

【技术特征摘要】
1、一种长效蛋白质药物，其特征为在药物蛋白质上连有一段小肽(或蛋白质)，该段小肽(或蛋白质)具有抗体Fc段结合活性。2、 如权利要求1所述的长效蛋白质药物，其特征为在人粒细胞集落刺激因子的C末端连接 有一段具抗体Fc段结合活性的小肽VETWKTSRISIF。3、 如权利要求l所述长效蛋白质药物的制备方法，其特征为将药物蛋白质与具有抗体Fc段 结合活性的小肽(或蛋白质)相连接，形成偶联蛋白。4、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征为所用连接方法为生物学方法，步骤包括-(1) 构建药物蛋白质和具有抗体Fc段结合活性的小肽(或蛋白质)的融合基因；(2) 将融合基因通过酶切、连接方法，或同源重组等方法克隆到表达载体中；(3) 用构建好的融合基因表达载体转化宿主细胞；(4) 选取序列正确的阳性克隆诱导表达融合蛋白；(5)...

【专利技术属性】
技术研发人员：王清明，范国才，陈吉中，傅一鸣，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]