一种检测乳蛋白含量的光激化学发光免疫定量试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测乳蛋白的光激化学发光免疫定量试剂盒和方法。该试剂盒包括：乳蛋白抗体包被的发光微粒、生物素标记的乳蛋白抗体、亲和素包被的感光微粒以及缓冲液溶剂。本发明专利技术的试剂盒和方法可以快速、灵敏、准确、专一性测定原料乳和乳制品及其他产品中酪蛋白、乳清蛋白等乳蛋白含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及乳蛋白检测领域，特别涉及一种检测乳蛋白含量的光激化学发光免疫 定量试剂盒及方法，适用于原料乳、乳制品、食品及饲料等乳蛋白含量的检测。
技术介绍
牛奶是一种组成复杂、结构有序、具有胶体溶液特征的生物营养溶液，牛奶的营养 素全面、易吸收，牛奶中含有的各种化学成分都是人体所必需的营养素，也是常人膳食中植 物性蛋白质的重要补充。牛奶中大约含有3000种化合物，其中主要成分有水、脂肪、蛋白 质、乳糖和矿物质，其微量成分有维生素、酶类、奁脂、色素、激素及生长因子、有机酸、气体 和体细胞等。牛奶中各主要成分的含量因牛种和品种(遗传因素)、年龄和胎次、泌乳阶段 和季节、饲养管理条件、产奶水平和挤奶技术，以及奶牛的个体特征和健康状况等有一定的 差别。牛奶约含3. 5 %的乳蛋白质(人奶约1.25%)，包括酪蛋白、a_乳清蛋白、乳球蛋 白、乳球蛋白和脂球膜蛋白、多种酶类等，其中以酪蛋白为主占蛋白总量86%左右，其次为 a-乳清蛋白约占总蛋白量的9%，乳球蛋白占总蛋白量的3%左右，它们都含有全部必须的 氨基酸，其相对含量与鸡蛋蛋白近似，消化率较高，为96. 1%。乳蛋白质含量是牛奶最重要 的质量指标之一，对于制造干酷和酸奶等乳制品的原料奶尤其重要，国家规定，只有乳蛋白 质含量> 的饮品才允许称为含乳饮料。牛奶中的酶有来母牛乳腺组织、血浆及白细胞的，称为原生酶，有来自微生物代谢 产物的，称为细菌酶，有几种酶被用来控制和检验牛奶质量，最重要的有过氧化氢酶、酌酸 酶和解脂酶等，牛奶中的酶对牛奶加工和乳品保存等方面都有影响。乳过氧化物酶是一种 血红素蛋白存在于乳中，牛奶中正常含量为30μ g/ml，其分子量为77. 5ku。乳过氧化物酶 /硫氰酸盐/过氧化氢(LP/SCN/H202)，简称为乳过氧化物酶体系(LP体系)，在牛奶中起强 有力的抗菌作用，是牛乳天然抗菌能力的物质基础。牛奶及乳制品的蛋白质含量检测的现行国家标准是根据化学定氮法测算总氮含 量来推算蛋白质含量，这也是国际通用的方法，但是这种方法不能分辨蛋白质的真伪，尤其 是不能识别化学物质如三聚氰胺、尿素等添加后转变成的“蛋白质”，“大头娃娃米粉”、“三 聚氰胺牛奶”事件的发生和蛋白含量检测方法的落后有直接的关系。能够精确定量检测原料乳及乳制品中特定蛋白含量的方法有高效液相色谱、毛细 管电泳和质谱联用检测，这些仪器设备非常昂贵需要数百万元，日常维护和运行成本也很 大，并且需要对样品进行繁琐的预处理，不适合生产中的常规检查。现在已有采用酶联免疫 方法检测牛奶及奶制品中的三聚氰胺，但是非均相反应，需要反复清洗与分离，检测程序繁 琐、耗时长、灵敏度和自动化程度不高，还有些比较方便快速的检测方法只能定性检测一个 大致的含量范围不能定量。光激化学发光免疫定量法是在化学发光免疫分析的基础上引入激光激发和纳米微球技术，采用抗体特异性免疫捕获目标分子，以发光物质作为信号放大系统，通过测定发 光强度检测免疫结合程度来定量，目标分子浓度和发光强度之间有很好的线性关系。光激 化学发光免疫定量法成功的解决了上述检测方法的不足，因为反应是在均相进行，操作简 单，样品不需要预处理，既加快了反应速度，又避免了反复分离与清洗的过程，可实现自动 化操作，由于其高度的特异性、抗干扰、测量速度快、灵敏度高、稳定性好等优点，有很好的 应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏度高的特异性检测乳蛋白含量的 光激化学发光免疫定量试剂盒及方法。本专利技术通过将乳蛋白抗体包被的发光微粒、生物素标记的乳蛋白抗体(乳蛋白抗 体与生物素的偶联物)以及亲和素包被的感光微粒，与被检测样品混合后，在均相条件下， 乳蛋白抗体可迅速特异性捕获样品中的乳蛋白，形成感光微粒_抗体_乳蛋白_抗体_发 光微粒复合体，在激光激发下，感光微粒能使周围环境中的氧转化为高能态离子氧，发光微 粒在近距离接受离子氧的激发后发射高能级光子，用光子计数器检测这些高能级光子，光 子数的多少即精确地反应乳蛋白分子的浓度，两者之间有良好的线性关系，通过标准曲线 将光强度换算成乳蛋白浓度。根据现有技术，反应中的高能态离子氧在溶液中生存时间只有4微秒，可传播直 径约为200nm，当样本中不含乳蛋白时，不能形成双抗体夹心的复合体，因距离太远活性氧 离子无法传递到发光微粒表面就已经在溶液中迅速淬灭，发光微粒不能被激发无高能级光 子产生。检测时原料乳及乳制品等样品不需要预处理可直接测定，仍然有很低的检测背景值。因此，本专利技术通过下列技术方案来解决上述问题一种检测乳蛋白含量的光激化 学发光免疫定量试剂盒，其中包括乳蛋白抗体包被的发光微粒、生物素标记的乳蛋白抗 体、亲和素包被的感光微粒以及缓冲液溶剂。根据本专利技术，所说的乳蛋白是指哺乳动物乳如牛乳、羊乳或马乳等乳中含有的蛋 白质，例如酪蛋白、a-乳清蛋白、乳球蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、酌酸酶 及解脂酶等；相应地，所说的乳蛋白抗体可以是以上述乳蛋白为抗原，以兔、鼠、羊等为免 疫动物制备的单克隆抗体或多克隆抗体，包括各种亚型，本专利技术的试剂盒中使用的乳蛋白 抗体可以选择其中的一个或多个，通常可以从市场购得。本专利技术优选兔抗牛的α-酪蛋白 (a-casein)多克隆抗体、兔抗牛的α-乳清蛋白(α-lactalbumin)多克隆抗体作为乳蛋 白抗体为例来具体说明。较佳地，试剂盒中还包括乳蛋白标准品，可以是以上抗体对应的抗 原，本专利技术的试剂盒中的标准品优选0. 1 μ g/ml酪蛋白溶液、0. 1 μ g/ml的a_乳清蛋白溶 液。根据本专利技术，所述的缓冲液溶剂，即乳蛋白检测时的反应溶液的溶剂可以是常规 的适合抗原抗体反应的溶剂体系，如HEPES缓冲体系、Tris缓冲体系等。但本专利技术优选 HEPES缓冲体系，可使检测方法更稳定。更优选地，所述的缓冲液溶剂为pH8. 0,0. 025M的 HEPES缓冲体系。所述的PH8. 00. 025M 的 HEPES 缓冲溶液每 IOOOml 含有 HEPES 6g, BSAlg, GlycerIOOg, Dextran-500 lg，Triton X-IOO 5g, EDTA-Na-2H20 0. 372g, Proclin-300 0. 5g。所述的缓冲液溶剂中还可添加起封闭和蛋白保护作用的物质，以及防止微粒聚集 的稳定试剂如Tween20，出于对试剂防腐及长期储存的考虑还可在溶剂中添加防腐剂，防腐 剂优选100U/ml庆大霉素和0. 05v/v%&Proclin300[2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MCI)] 作为防腐剂。根据本专利技术，上述发光微粒是指填充有发光化合物和镧系元素化合物的高分子微 粒，其中，发光化合物可以是Dioxene(二氧杂环乙烯)或thioxene (二甲基噻吩)的衍生物 等，镧系元素化合物可以是Eu (TTA) 3/Τ0Ρ0或Eu (TTA) 3/Phen等，这些微粒可由市场上购得。 发光微粒的发光量会直接影响最终检测的发光效果，市场提供的发光微粒发光量一般会在 50，000 10，000, 000光子数/IOOug发光微粒范围内，本专利技术优选150，000 350，000光 子数/IOOug发光微粒。由于最终的检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测乳蛋白的光激化学发光免疫定量试剂盒，其特征在于其包括：乳蛋白抗体包被的发光微粒、生物素标记的乳蛋白抗体、亲和素包被的感光微粒以及缓冲液溶剂。

【技术特征摘要】
一种检测乳蛋白的光激化学发光免疫定量试剂盒，其特征在于其包括乳蛋白抗体包被的发光微粒、生物素标记的乳蛋白抗体、亲和素包被的感光微粒以及缓冲液溶剂。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的缓冲液溶剂为PH8.025mM HEPES缓 冲液。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的PH8.025mM HEPES缓冲液每IOOOml 含有 HEPES 6g, BSA lg, Glycer 100g, Dextran-500 lg，Triton X-100 5g，EDTA-Na_2H20 0. 372g, Proclin-300 0. 5g。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的乳蛋白抗体包被的发光微粒由下述 方法制得1)混合将发光微粒与乳蛋白抗体混合于MES缓冲液中，其中发光微粒的浓度为10 40mg/ml ；2)反应加入MES缓冲液配制的NaBH3CN溶液混合并反应；3)封闭加入MES缓冲液配制的Glycin及NaBH3CN溶液，混勻反应后，再加入BSA溶液 封闭；4)清洗产物，获得乳蛋白抗体包被的发光微粒。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于步骤1)...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛晓伏，
申请(专利权)人：毛晓伏，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]