【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物技术和分子生物学领域，特别涉及通用的诱导型启动子、基于其的载体和宿主细胞，以及涉及用于产生所述宿主细胞的方法。所提出的专利技术使得可以分析目标蛋白例如受体配体，例如细胞因子的活性。
技术介绍
1、各种治疗活性多肽(例如单克隆抗体、融合蛋白、各种细胞因子、受体配体等)已证明其作为用于治疗许多病症和疾病的有效药物的价值。
2、为了开发新的治疗活性多肽，有必要进行功能测试以确定给定治疗活性多肽的生物活性。
3、治疗活性多肽的生物活性测试是一套技术，其用于评估候选药物，并且以使用原代细胞培养物和特化细胞系两者(在体外)，或使用实验动物(在体内)来分析分子的生物活性为基础。来自功能测试的数据提供关于候选治疗活性多肽的活性的信息。
4、功能测试可分为以下几组：
5、1)比活性(细胞增殖的刺激和抑制、细胞毒性/凋亡、抗病毒活性、分化、迁移等)的测试；
6、2)报告基因表达的测试。
7、增殖/细胞毒性调节测试是大多数治疗活性多肽的最通用的测试。这些测试通过治疗活性多肽增加或降低细胞增殖的能力来测量其水平和活性。该方法以追踪细胞响应测试样品的生长或死亡为基础(banks re.measurement of cytokines in clinicalsamples using immunoassays:problems and pitfalls.crit rev clin lab sci.2000年4月；37(2):131-82.doi:10.1080/104
8、此类测试已在抗增殖活性测定中建立了应用，例如研究人员评估了ifn-β-1a减少wish细胞生长的能力(renato mastrangeli等人,in vitro biologicalcharacterization of ifn-β-1a major glycoforms,glycobiology,第25卷,第1期,2015年1月,第21–29页,https://doi.org/10.1093/glycob/cwu082)。
9、另一个值得注意的实例是广泛用于评估细胞免疫的淋巴细胞增殖测定(nikbakht,m.等人,evaluation of a new lymphocyte proliferation assay based oncyclic voltammetry；an alternative method.sci rep 9,4503(2019).https://doi.org/10.1038/s41598-019-41171-8)。迄今为止，如下多种细胞因子的细胞增殖测定是商业可获得的：ifn-γ、il-1α、il-1β、il-2、3、4、5、6、7、8、10、13、15、19、21、33。
10、报告基因典型地用于细胞测定，以追踪在转录和/或翻译水平上受体介导的表达变化。这些优化的基因在启动子内的敏感元件控制下表达，并且转录因子与其结合。
11、phyllis a.rees、r.joel lowy已经报道了使用报告细胞系来测量1型干扰素，作为耗时且费力的增殖测定的替代方法(phyllis a.等人,measuring type i interferonusing reporter gene assays based on readily available cell lines,journal ofimmunological methods,第461卷,2018,第63-72页,issn 0022-1759,https://doi.org/10.1016/j.jim.2018.06.007)。
12、jacqueline mock等人已经开发了一个报告系(reporter line)，其包括在nf-kb依赖性启动子控制下的萤光素酶基因。由常规测试(诸如ctll-2增殖测定、检测inf-γ诱导的il-12的elisa、tnf的细胞毒活性的测量)产生了类似的细胞系(mock j.等人,auniversal reporter cell line for bioactivity evaluation of engineeredcytokine products.sci rep.2020；10(1):3234.2020年2月24日出版.doi:10.1038/s41598-020-60182-4)。
13、zeuner mt等人已经报道了使用包括nf-kb敏感的启动子和萤光素酶基因的报告细胞系来研究神经炎症。该测定使得可以评估促炎分子和肽以及抗炎药物在神经细胞中的功效(marie-theres zeuner等人,development and characterisation of a novel nf-κb reporter cell line for investigation of neuroinflammation,mediatorsinflamm,2017,doi:10.1155/2017/6209865)。
14、wang等人已经开发了基于在sie(血清应答元件)控制下表达萤光素酶的细胞系的增殖测定的类似方法(wang l.等人,development of reporter gene assays todetermine the bioactivity of biopharmaceuticals,biotechnology advances(2018),https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.107466)。
15、当与常规的比活性测定相比，报告细胞的优点包括以下：
16、1)易于重现的结果、自动化和可缩放(scaling)；
17、2)对目标药物的特异性；
18、3)高水平的敏感性、低水平的背景激活；
19、4)容易使用、容易检测报告信号。
20、当与常规的比活性测定相比，报告细胞的缺点包括为目标药物开发单独的报告细胞的漫长过程，因为它可以持续长达数月。
21、因此，需要可用于确定多种不同的治疗活性多肽(而不是仅一种单独的治疗活性多肽)的生物活性的报告细胞。
技术实现思路
1、本专利技术的作者开发了一种包含转录因子stat3、stat5和ap-1的结合位点和最小启动子的通用的诱导型启动子，以及基于其的载体和宿主细胞，这使得可以确定多种不同的治疗活性多肽(而不是仅一种单独的治疗活性多肽)的生物活性。
2、专利技术简述
3、在一个方面，本专利技术涉及一种诱导型启动子，其包含转录因子stat3、stat5和ap-1的结合位点和最小启动子。
4、在本专利技术的一些实施方案中，诱导型启动子包含转录因子stat3的结合位点，其为选自包含seq id no:1、seq id no:2或seq id本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种诱导型启动子，其包含转录因子STAT3、STAT5和AP-1的结合位点和最小启动子。
2.根据权利要求1所述的诱导型启动子，其中所述转录因子STAT3的结合位点是选自包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的诱导型启动子，其中所述转录因子STAT5的结合位点是选自包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的核苷酸序列的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的诱导型启动子，其中所述AP-1家族转录因子的结合位点是选自包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的诱导型启动子，其中所述转录因子STAT3、STAT5和AP-1的结合位点从5'端至3'端依次按以下顺序排列：STAT3-STAT5-AP-1。
6.根据权利要求5所述的诱导型启动子，其中所述转录因子STAT3、STAT5和AP-1的结合位点从5'端至3'端依次按以下顺
7.根据权利要求1所述的诱导型启动子，其中所述转录因子STAT3、STAT5和AP-1的结合位点包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列。
8.根据权利要求1所述的诱导型启动子，其中所述最小启动子包含TATA盒。
9.根据权利要求1所述的诱导型启动子，其中所述最小启动子包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
10.一种诱导型表达载体，其在5'端至3'端方向上包含根据权利要求1至9中任一项所述的诱导型启动子和报告基因。
11.根据权利要求10所述的诱导型表达载体，其中所述报告基因是萤火虫萤光素酶蛋白的基因。
12.根据权利要求11所述的诱导型表达载体，其中所述萤火虫萤光素酶蛋白的基因包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列。
13.根据权利要求10所述的诱导型表达载体，其包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
14.一种用于产生用于分析目标蛋白活性的宿主细胞的方法，其包含用根据权利要求10至13中任一项所述的诱导型表达载体转化所述细胞。
15.一种用于分析目标蛋白活性的宿主细胞，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的诱导型启动子和报告基因。
16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中所述报告基因是萤火虫萤光素酶蛋白的基因。
17.根据权利要求16所述的宿主细胞，其中所述萤火虫萤光素酶蛋白的基因包含SEQID NO:15的核苷酸序列。
18.根据权利要求15所述的宿主细胞，其包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
19.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中所述目标蛋白是受体配体。
20.根据权利要求19所述的宿主细胞，其中所述受体配体是细胞因子。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种诱导型启动子，其包含转录因子stat3、stat5和ap-1的结合位点和最小启动子。
2.根据权利要求1所述的诱导型启动子，其中所述转录因子stat3的结合位点是选自包含seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3的核苷酸序列的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的诱导型启动子，其中所述转录因子stat5的结合位点是选自包含seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6的核苷酸序列的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的诱导型启动子，其中所述ap-1家族转录因子的结合位点是选自包含seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9的核苷酸序列的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的诱导型启动子，其中所述转录因子stat3、stat5和ap-1的结合位点从5'端至3'端依次按以下顺序排列：stat3-stat5-ap-1。
6.根据权利要求5所述的诱导型启动子，其中所述转录因子stat3、stat5和ap-1的结合位点从5'端至3'端依次按以下顺序排列：stat3-stat5-ap-1，并且包含选自包含seq idno:10、seq id no:11或seq id no:12的核苷酸序列的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的诱导型启动子，其中所述转录因子stat3、stat5和ap-1的结合位点包含seq id no:13的核苷酸序列。
8.根据权利要求1所述的诱导型启...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·V·科诺诺夫，M·V·日里亚科娃，A·A·戈尔迪夫，M·Y·普奇科娃，V·V·索洛维耶夫，D·V·莫洛佐夫，
申请(专利权)人：拜奥卡德联合股份公司，
类型：发明
国别省市：
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