【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种(2s,3s)-2,3-二氢-3-羟基-2-芳基-1,5-苯并硫氮杂卓-4(5h)-酮类化合物的制备方法。
技术介绍
1、(2s,3s)-2,3-二氢-3-羟基-2-芳基-1,5-苯并硫氮杂卓-4(5h)-酮是一类在c1和c5位含有硫和氮元素的七元环特殊骨架的手性化合物。因结构中含有两个连续的手性中心，表现出多样的生物活性和药物活性。含有该类结构的临床药物包括地尔硫卓(diltiazem)等。其结构式如下式(i)所示，式中r1为氢、氯；r2为氟、氯、溴等卤素，甲基，甲氧基，叔丁基，三氟甲基。
2、
3、目前关于通过动态还原动力学拆分合成化合物(i)及其结构类似物的化学方法有很多报道，但这些化学方法普遍存在一些不足之处，如需要用到金属或有机催化剂等(j.org.chem.1996,61,8586-8590)。不仅反应条件苛刻，价格昂贵，而且严重污染环境，这大大限制了其在工业生产上的应用。另一方面，生物催化动态还原动力学拆分方法由于其高立体选择性以及对环境友好等特点而被大家所关注，但很少被用于合成化合物(i)。研究人员matsunae，nishida等曾以面包酵母和球形芽孢杆菌作为全细胞催化剂来研究过2-(4-甲氧基苯基)-1,5-苯并硫氮杂卓-3,4-(2h,5h)-二酮(iia)的动态动力学拆分还原生成(2s,3s)-2,3-二氢-3-羟基-2-(4-甲氧基苯基)-1,5-苯并硫氮杂卓-4(5h)-酮(ia)，取得了高收率和高立体选择性(j.ferment.bioeng.1
4、本专利技术利用羰基还原酶催化动态还原动力学拆分化合物(ii)，高效、高立体选择性地合成化合物(i)。具有反应条件温和、反应收率高、成本低廉等优点，具备良好的工业应用价值。
技术实现思路
1、本专利技术目的在于提供一种底物普适性广、高底物浓度、高立体选择性、高收率的不对称还原反应合成(2s,3s)-2,3-二氢-3-羟基-2-芳基-1,5-苯并硫氮杂卓-4(5h)-酮类化合物的方法。
2、本专利技术采用羰基还原酶催化不对称还原2-芳基-1,5-苯并硫氮杂卓-3,4-(2h,5h)-二酮类化合物，生成化合物(2s,3s)-2,3-二氢-3-羟基-2-芳基-1,5-苯并硫氮杂卓-4(5h)-酮(i)；所述2-芳基-1,5-苯并硫氮杂卓-3,4-(2h,5h)-二酮类化合物，其结构式为(ii)所示：
3、
4、式中r1为氢、氯；r2为氟、氯、溴等卤素，甲基，甲氧基，叔丁基，三氟甲基；
5、制备的具体步骤为：
6、(1)制备含羰基还原酶的第一工程菌和含葡萄糖脱氢酶的第二工程菌；
7、(2)分别制备两种工程菌的静息细胞悬浊液；
8、(3)分别制备含羰基还原酶的细胞上清液和含葡萄糖脱氢酶的细胞上清液；
9、(4)将上述两种细胞上清液混合，然后再与化合物(ii)、溶剂、氢供体和辅因子混合，进行不对称还原反应，制得化合物(i)；其反应式，如下：
10、
11、其中，所述氢供体为葡萄糖，所述辅因子为nadp+/nadph；所述羰基还原酶选自kdoadh，ygl039w和ydr368w，三者的对应氨基酸序列如seq id no.1至seq id no.3所示。
12、kdoadh(seq id no.1)：
13、msfvlvsgasgyiaqhtirillakgykvigtvrtqekadsvarlfnndnlalelvpeladidafdhvfekyntqikhvihtaspvrynmtdfenemllpaingtksvlesikkfsadsvetvvytssisalanpagifepettlteeswnpdtwedaikdvrsayfgsktfaerstwqfieenrdqvkfqltticpgyvlgpqafdenakghlcysgelvngiltskpgdtidqhlagafidvrdvarahvlpledhrfanqrlvlmnkrfalqdvadyisgnfpelkgkisvgvpgsgadtvettskydnsktrellgfdfvpfeksvtdsvdqilaanke；
14、ygl039w(seq id no.2)：
15、mttektvvfvsgatgfialhvvddllktgykvigsgrsqekndgllkkfksnpnlsmeive
16、diaapnafdkvfqkhgkeikvvlhiaspvhfnttdfekdllipavngtksileaiknyaadtv
17、ekvvitssvaalaspgdmkdtsfvvneeswnkdtwescqanavsaycgskkfaektawdf
18、leenqssikftlstinpgfvfgpqlfadslrnginsssaiianlvsyklgdnfynysgpfidvrd
19、vskahllafekpecagqrlflcedmfcsqealdilneefpqlkgkiatgepgsgstfltkncckcdnrktknllgfqfnkfrdcivdtasqllevqsks；
20、ydr368w(seq id no.3)：
21、mpatlknssatlklntgasipvlgfgtwrsvdnngyhsviaalkagyrhidaaaiylneee
22、vgraikdsgvpreeifittklwgteqrdpeaalnkslkrlgldyvdlylmhwpvplktdrv
23、tdgnvlciptledgtvdidtkewnfiktwelmqelpktgktkavgvsnfsinnikellespn
24、nkvvpatnqieihpllpqdeliafckekgivveayspfgsanapllkeqaiidmakkhgvepa
25、qliiswsiqrgyvvlaksvnperivsnfkiftlpeddfktisnlskvhgtkrvvdmkwgsfpifq。
26、本专利技术步骤(1)中，所述羰基还原酶工程菌含有表达载体pet28a-kdoadh,pet28a-ygl039w或pet28a-ydr368w，所述葡萄糖脱氢酶工程菌含有表达载体pet28a-gdh，宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。
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1.一种(2S,3S)-2,3-二氢-3-羟基-2-芳基-1,5-苯并硫氮杂卓-4(5H)-酮类化合物的制备方法，其特征在于，采用羰基还原酶催化不对称还原2-芳基-1,5-苯并硫氮杂卓-3,4-(2H,5H)-二酮类化合物生成化合物(2S,3S)-2,3-二氢-3-羟基-2-芳基-1,5-苯并硫氮杂卓-4(5H)-酮类化合物(I)；所述2-芳基-1,5-苯并硫氮杂卓-3,4-(2H,5H)-二酮类化合物的结构式为(II)所示：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述工程菌含有表达载体pET28a-KdoADH,pET28a-YGL039w和pET28a-YDR368w，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述制备两种工程菌的静息细胞悬浊液，具体步骤为：将第一工程菌或第二工程菌接种到含卡那霉素的培养基上，摇床活化后，扩大培养至OD600值达到0.6-0.8时，加入诱导剂，继续培养，离心收集细胞，用缓冲液重悬，获得第一静息细胞悬浊液或所述第二静息细胞悬浊液。
4.如权利要求3所述
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述制备两种细胞上清液，具体步骤为：对所述第一静息细胞悬浊液或所述第二静息细胞悬浊液进行超声破碎，离心，获得所述第一细胞上清液或所述第二细胞上清液。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述两种细胞上清液的混合液中，第一细胞上清液和第二细胞上清液的体积比为2:1-20:1。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)的反应中，所述化合物(II)的浓度为5-200mM，所述氢供体的浓度为10-400mM，所述辅因子的浓度为0.05-1mM。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)的不对称还原反应中，反应温度为25-40℃，反应缓冲液pH为6.5-8.0，缓冲浓度为50-200mM。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)的不对称还原反应中，所述溶剂为磷酸盐缓冲液与助溶剂的混合溶剂；其中，助溶剂选自高介电常数溶剂、芳香族溶剂、非极性溶剂、极性溶剂；所述高介电常数溶剂为二甲基亚砜，所述芳香族溶剂为苯或甲苯，所述非极性溶剂为正己烷或环己烷，所述极性溶剂为乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇或异丙醇。
10.如权利要求1-9之一所述的制备方法，其特征在于，在整个反应过程中，待反应至NMR检测底物完全耗尽后，用等体积的乙酸乙酯萃取3-4次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去有机溶剂，再通过柱层析或者制备型薄层色谱纯化得到目标产物I。
...【技术特征摘要】
1.一种(2s,3s)-2,3-二氢-3-羟基-2-芳基-1,5-苯并硫氮杂卓-4(5h)-酮类化合物的制备方法，其特征在于，采用羰基还原酶催化不对称还原2-芳基-1,5-苯并硫氮杂卓-3,4-(2h,5h)-二酮类化合物生成化合物(2s,3s)-2,3-二氢-3-羟基-2-芳基-1,5-苯并硫氮杂卓-4(5h)-酮类化合物(i)；所述2-芳基-1,5-苯并硫氮杂卓-3,4-(2h,5h)-二酮类化合物的结构式为(ii)所示：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述工程菌含有表达载体pet28a-kdoadh,pet28a-ygl039w和pet28a-ydr368w，宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述制备两种工程菌的静息细胞悬浊液，具体步骤为：将第一工程菌或第二工程菌接种到含卡那霉素的培养基上，摇床活化后，扩大培养至od600值达到0.6-0.8时，加入诱导剂，继续培养，离心收集细胞，用缓冲液重悬，获得第一静息细胞悬浊液或所述第二静息细胞悬浊液。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述诱导剂为iptg，诱导剂的浓度为0.1-1.0mm；加入诱导剂后的培养条件为：培养温度为16-30℃，培养时间为16-18h；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为50-200mm。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中...
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