本发明专利技术保护了一种检测成纤维细胞生长因子21的方法，用自主开发的兔单抗抗体对制成的夹心法Elisa试剂盒，包括步骤：a制备FGF21抗体对原料；b链霉亲和素微孔板的制备：用碳酸钠缓冲液溶解链霉亲和素，每孔加入50‑200ul，0‑4℃包被过夜；c生物素标记抗体的制备；d酶标抗体的制备：选择酶用于标记FGF21检测抗体，将标记好的抗体置换于PBS缓冲液中，保存备用；e ELISA一步法的建立。该方法简化现有技术中测定FGF21步骤，缩短操作时间，提高检测效率。此外，采用了链霉亲和素‑生物素系统，具有信号放大作用，因而可提高酶联免疫吸附反应的灵敏度，为微量抗原、抗体的检测开辟了新的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术单克隆抗体制备领域，具体涉及一种检测成纤维细胞生长因子21的方法。
技术介绍
1、成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21,fgf21)属于fgf家族，于2000年nishimura等人在小鼠胚胎中发现。fgf21是一种分泌蛋白，由210个氨基酸组成，其中约30个氨基酸构成信号肽。该基因主要是在肝脏中进行特异性地表达，但在骨骼肌、胸腺和胰腺细胞等也有表达。研究已表明fgf21是一种新的糖脂代谢调节因子，有助于脂肪代谢，促进葡萄糖吸收，促进胰岛素分泌。fgf21具有治疗糖尿病药物所必须的一些特性，并且不会产生目前糖尿病治疗中常见的低血糖和水肿两个副作用，有望成为治疗糖尿病的理想药物。另外，fgf21对细胞没有明显的促有丝分裂作用，由此可大幅降低临床用药风险，对治疗具有极大的应用前景。目前已有临床研究发现fgf21类似物在治疗糖尿病、肥胖症以及非酒精性脂肪性肝炎方面具有很好潜力。基于上述优点,近年来fgf21成为了研究热点，与此同时对fgf21的检测也提出了更高的要求。目前，对fgf21的免疫检测方法是采用传统的elisa夹心法，该方法检测时间较长。本方案拟采用我们自主研发的一步法对其进行检测，由此可简化测定步骤，缩短操作时间，提高检测效率。此外，由于传统检测方法的灵敏度有限，当样品中的抗原含量较少时，其检测结果有时仍为阴性，因而导致误断。然而，由于一步法采用了链霉亲和素-生物素系统，具有信号放大作用，因而可提高酶联免疫吸附反应的灵敏度，为微量抗原、抗体的检测开辟了新的途径。
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br/>技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供了一种检测成纤维细胞生长因子21的方法，包括以下步骤：
2、a制备fgf21抗体对原料；
3、b链霉亲和素微孔板的制备：用碳酸钠缓冲液溶解链霉亲和素，每孔加入50-200ul，0-4℃包被过夜；
4、c生物素标记抗体的制备：用dmso将生物素溶解，将生物素和fgf21捕获抗体按摩尔比1:10-1:50体积比混合，室温静置2h，除去多余的自由态生物素，置换于pbs缓冲液，保存备用；
5、d酶标抗体的制备：选择酶用于标记fgf21检测抗体，将标记好的抗体置换于pbs缓冲液中，保存备用；
6、e elisa一步法的建立：将所述生物素标记抗体、待检样品和酶标抗体各20-150ul/孔加入经链霉亲和素包被的微孔板中，孵育，洗涤，拍干，加入底物，显色后终止反应。
7、作为本专利技术实施例的一个优选方案，上述步骤a包括fgf21抗原制备：
8、①选取fgf21蛋白的氨基酸序列为aa29-209，氨基酸序列：hpipdsspllqfggqvrqrylytddaqqteahleiredgtvggaadqspesllqlkalkpgviqilgvk tsrflcqrpdgalygslhfdpeacsfrellledgynvyqseahglplhlpgnksphrdpaprgparflp lpglppalpeppgilapqppdvgssdplsmvgpsqgrspsyas；
9、②构建fgf21质粒；
10、③将构建的fgf21质粒在真核细胞表达系统做瞬时表达，收取纯化后fgf21重组蛋白用于抗原制备。
11、作为本专利技术实施例的一个优选方案，上述步骤a包括动物免疫：
12、选取免疫动物；
13、fgf21重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后用作免疫用抗原；
14、首次免疫：每只动物多点注射合计0.2-0.5mg乳化后抗原；
15、两周后第二次免疫：每只动物多点注射合计0.2-0.5mg乳化后抗原；
16、一周后第三次免疫：每只动物多点注射合计0.2-0.5mg乳化后抗原；
17、两周后第四次免疫：每只动物多点注射合计0.2-0.5mg乳化后抗原；
18、两周后第五次免疫：每只动物多点注射合计0.2-0.5mg乳化后抗原；
19、一周后取少量全血，离心制备抗血清用于血清滴度测试；
20、一周后静脉注射0.2-0.5mg不含佐剂fgf21重组蛋白加强免疫。
21、作为本专利技术实施例的一个优选方案，上述步骤a还包括：抗血清检测、单个b细胞培养以及fgf21阳性孔筛选、阳性孔的抗体基因质粒构建与抗体的表达、棋盘筛选抗体配对、抗体配对的大规模生产。
22、作为本专利技术实施例的一个优选方案，上述免疫动物为兔子，绵羊，豚鼠中的一种。
23、作为本专利技术实施例的一个优选方案，上述单个b细胞培养以及fgf21阳性孔筛选包括：
24、①分离全血b淋巴细胞；
25、②将分离的b淋巴细胞以3000个细胞/孔铺至有fgf21抗原包板的无菌96孔标板，过夜培养；
26、③用含10％-20％胎牛血清的pbs清洗两遍；
27、④清洗后剩余的b淋巴细胞用1640培养基培养；
28、⑤培养5天后取上清并用elisa间接法筛选阳性孔。
29、本专利技术的有益效果是：本专利技术基于链霉亲和素-生物素系统，每个链霉亲和素可结合4个生物素，从而具有多级放大作用，提高fgf21检测灵敏度；将链霉亲和素包被于微孔板中，如此不仅易于保存，而且避免了抗体包被时出现的失活现象；生物素标记fgf21抗体、样本中的抗原和酶标fgf21抗体形成的复合物通过生物素与微孔板上的亲和素结合，由于亲和素与生物素的结合具有极高的亲和力，使反应具有高度专一性和稳定性；同时本专利技术方法采用一步法，可简化操作步骤，缩短检测时间，适于广泛应用。
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【技术保护点】
1.一种检测成纤维细胞生长因子21的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测成纤维细胞生长因子21的方法，其特征在于，所述步骤a还包括FGF21抗原制备：
3.根据权利要求1所述的检测成纤维细胞生长因子21的方法，其特征在于，所述步骤a还包括动物免疫步骤：
4.根据权利要求1所述的检测成纤维细胞生长因子21的方法，其特征在于，所述步骤a还包括：抗血清检测、单个B细胞培养以及FGF21阳性孔筛选、阳性孔的抗体基因质粒构建与抗体的表达、棋盘筛选抗体配对、抗体配对的大规模生产。
5.根据权利要求3所述的检测成纤维细胞生长因子21的方法，其特征在于，所述免疫动物为兔子，绵羊，豚鼠中的一种。
6.根据权利要求4所述的检测成纤维细胞生长因子21的方法，其特征在于，所述单个B细胞培养以及FGF21阳性孔筛选包括：
【技术特征摘要】
1.一种检测成纤维细胞生长因子21的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测成纤维细胞生长因子21的方法，其特征在于，所述步骤a还包括fgf21抗原制备：
3.根据权利要求1所述的检测成纤维细胞生长因子21的方法，其特征在于，所述步骤a还包括动物免疫步骤：
4.根据权利要求1所述的检测成纤维细胞生长因子21的方法，其特征在于，所述步骤a...
【专利技术属性】
技术研发人员：李剑，梁庆环，
申请(专利权)人：杭州戴格生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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