【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开一种m28家族肽酶及制备方法，同时还提供了其在驯化免疫激动剂类疫苗佐剂中的用途，属于生物医药。
技术介绍
1、疫苗是预防和控制疾病感染的有效措施。近年新型疫苗如：亚单位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗等疫苗需要疫苗佐剂增强其免疫原性，凸显了疫苗佐剂挖掘的重要性，疫苗佐剂的选择需要考虑以下因素：给药途径（肌肉注射、粘膜注射、腹膜内注射），所需的免疫反应类型（th1和th2细胞免疫的偏向、mhc分子共受体的偏向），病原体类型，抗原类型（亚单位抗原、mrna抗原），以及疾病的发展阶段。此外，为了投入市场应用还需要考虑佐剂的安全性和经济性，还必须满足规模化生产的需求。
2、目前在生物医药
，铝盐佐的剂效应到如今陆续有五种疫苗佐剂获批应用于人体，包括铝佐剂、as01、as04、as03和cpg odns 1018。微生物及其代谢产物具有易获取、成本低，易刺激机体的免疫反应等优点，微生物佐剂在疫苗佐剂中均发挥着不可忽视的作用。尽管已有多种佐剂被许可使用，然而这些现有的佐剂仍存在诸多问题或不足，传统的经典佐剂具有良好的生物安全性，但其免疫刺激能力有限，急需新的佐剂来弥补这一缺点。因此，在未来疫苗佐剂的研究中，一方面可以对经典佐剂进行性能优化或配方改进，如降低毒性、提取主要活性成分、改造物理性状等。另一方面，可以挖掘开发一些新型佐剂，尤其是可以增强天然免疫反应的驯化免疫佐剂，开发不仅增强适应性免疫，还可以增强先天免疫反应的“双记忆”疫苗。
技术实现思路
1、本专利技术的目
2、本专利技术所述的一种m28家族肽酶，是由耐寒周芽孢杆菌产生的驯化免疫激动剂，其氨基酸序列如seq id no.1所示，编码基因如seq id no.2所示。
3、本专利技术的目的之二在于提供的m28家族肽酶的纯化制备方法，包括如下步骤：
4、（1）发酵上清制备：将-80℃冻存的耐寒周芽孢杆菌于tsb固体培养基上划线，37℃恒温培养至出现单菌落，然后挑取单菌落至5 ml tsb液体培养基中，37℃、180 r/min振荡培养4 h，然后以1%（v/v）比例转接至10 l tsb液体培养基中，37℃、180 r/min振荡培养14h，10000× g、4℃下离心10 min，0.22 μm滤器过滤得发酵上清；
5、（2）m28家族肽酶的粗提：将发酵上清以80%饱和度硫酸铵溶液在4℃沉淀16 h，然后12000× g、4℃下离心20 min，收集沉淀，使用蒸馏水复溶，然后用1 kda的透析袋透析除去硫酸铵，采用1%氯化钡检测硫酸铵是否除干净，最后通过真空冷冻干燥浓缩粗提物；
6、（3）纯化：将粗提物通过q-tanrose 6ff阴离子交换层析柱，采用阶梯固定梯度洗脱方式（0.1m、0.2m、0.3m、0.5m、0.7m、1.0m nacl），每个梯度洗脱3个柱体积，流速为1 ml/min，以280 nm为检测波长，收集各洗脱峰。通过小鼠腹腔巨噬细胞天然免疫记忆模型，测定各洗脱峰的驯化免疫诱导活性（图1a）；进一步将目标峰利用g50葡聚糖凝胶过滤层析柱，采用无菌蒸馏水进行洗脱，以蠕动泵控制流速为1 ml/min，以280 nm为检测波长，收集各洗脱峰，利用小鼠腹腔噬细胞天然免疫记忆模型，测定诱导天然免疫记忆的目标活性峰（图1b），最后将目标峰利用ultimate xb-c18液相色谱柱经hplc进行纯化，流动相a为蒸馏水（含有0.1%三氟乙酸）；b为乙腈，线性梯度洗脱，洗脱程序为：0-5 min，20% b相洗脱；5-25 min，20%-100% b相洗脱；25-30 min，100% b相洗脱。同样通过小鼠腹腔巨噬细胞驯化免疫模型进行检测各洗脱峰的活性（图1c-h），多次重复进样，收集具有驯化免疫诱导作用的活性峰fr4-2-4，冷冻干燥获得m28家族肽酶。
7、本专利技术的目的之三在于提供m28家族肽酶的重组表达方法；包括如下步骤：
8、（1）构建表达载体：设计引物，扩增m28家族肽酶基因，经酶切、连接、转化，构建bl21-pet-28a-m28重组表达体系（图2a、b）；
9、其中，上游引物：5’-ctggagctcatgaaaaaacaatttctgtcg-3’，
10、下游引物：5’-ctgctcgagtttgaattccttttcgc-3’；
11、（2）诱导表达：得到的重组表达菌株在37℃，180 r/min震荡培养至od600=0.6-0.8时，再加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷至终浓度为500 μmol/l，16℃，160 r/min诱导24 h；
12、（3）纯化：将诱导培养好的菌液于4℃条件下经8000× g离心10 min，收集菌体；超声破碎菌体，于4℃条件下经10000× g离心20 min，收集上清，用0.45μm滤膜过滤，通过镍柱进行亲和层析纯化，分别用20 mm、100 mm咪唑洗脱上样后的镍柱，收集100 mm咪唑洗脱部分，最后通过10kda超滤管超滤除去咪唑、甘油等杂质，然后进行真空冷冻干燥纯化得到重组表达m28家族肽酶（图2c），经小鼠腹腔巨噬细胞免疫模型验证重组表达的m28家族肽酶具有与天然纯化的m28家族肽酶相当的驯化免疫诱导活性。
13、本专利技术的目的之四在于提供m28家族肽酶的佐剂效应应用分析，包括如下步骤：
14、m28家族肽酶的佐剂效应通过测定m28家族肽酶和ova免疫小鼠的免疫水平来评估。本研究将50只，体重在20 g左右的六周龄雌性c57/bl6j小鼠随机分为空白对照组（saline）、阴性对照组（ova）、阳性对照组（ova+alum）、ova+m28家族肽酶低剂量组（ova+4mg/kg m28）、ova+m28家族肽酶高剂量组（ova+20mg/kg m28），每组十只小鼠。小鼠佐剂效应的免疫程序如图4a，在实验的第1 d进行第一次免疫，第15 d进行第二次加强免疫，共两次免疫。在第29 d、36 d、43 d、50 d，利用elisa法检测血清中ova特异性抗体igg、igg1、igg2c水平。结果如图4所示，各组小鼠的体重无明显差异（图4b）。与ova组相比，ova+m28家族肽酶免疫后小鼠脾脾组织重量稍有增加（图4c）；ova+m28家族肽酶实验组的小鼠脾组织生发中心在大小和数量上都明显增加（图4h）；cck8法检测结果显示，ova+m28家族肽酶免疫的小鼠脾细胞增殖能力显著增强（图4d），表明m28本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种M28家族肽酶，是由耐寒周芽孢杆菌产生的驯化免疫激动剂，其特征在于：
2.如权利要求1所述M28家族肽酶的纯化制备方法，包括如下步骤：
3.如权利要求1所述M28家族肽酶的一种重组表达方法，其特征在于包括以下步骤：
4.如权利要求1所述的M28家族肽酶在制备疫苗佐剂中的用途。
【技术特征摘要】
1.一种m28家族肽酶，是由耐寒周芽孢杆菌产生的驯化免疫激动剂，其特征在于：
2.如权利要求1所述m28家族肽酶的纯化制备方法，包括如下步骤：
【专利技术属性】
技术研发人员：杨勇军，彭自然，骆雪月，张建刚，陈巍，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
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