【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及单粒子定位显微镜和用于在样品区域中定位单个粒子的方法。
技术介绍
1、在光学显微术领域，允许以低于衍射分辨率极限的精度定位单个粒子的方法已变得可用。这些方法可以被用于扩散粒子的单粒子追踪和超分辨率成像。
2、例如，用于超分辨率荧光成像的技术基于当偏振光束通过双轴晶体衍射时发生的锥形衍射。基于这种技术的方法以首字母缩略词为人所知，诸如codim(锥形衍射显微术)、包括psit(具有各种拓扑的强度的投影序列)的srcd(使用锥形衍射的超分辨率)，以及pdos(位置相关的光学信号量)。根据这些方法，可以通过用一系列光图案顺序照亮发射体、测量在用各个光图案照亮期间发射的光的强度，并计算与测得的光强度的集合相匹配的发射体位置来定位单个荧光发射体。
3、如上解释的方法公开于wo 2012/049381 a2、wo 2013153294 a1和wo 2019/043458 a2中。另外，参考julien caron等人的出版物，conical diffractionillumination opens the way for low phototoxicity super-resolution imaging，cell adhesion&migration(2014)，第430–439页，doi:10.4161/cam.29358；clémentfallet等人，conical diffraction as a versatile building block to implement newim
4、上面提到的方法在尚未考虑的粒子位置的定位方面遭受模糊的不确定性。因此，当基于响应于照明光图案的序列测得的光强度的序列计算发射体位置时，出于对称性的原因，确定与测得的光强度同等匹配的多个潜在发射体位置，并且不清楚这些位置中的哪一个表示实际的发射体位置。
5、到目前为止，还没有有效的解决方案来解决这个模糊的问题。可以考虑在多个潜在位置之一处简单地重复定位测量序列以查明这个位置是否是实际的发射体位置。但是，由于复杂测量序列的重复，这种解决方案会是缓慢的。特别地，这将涉及诸如扫描镜之类的光学扫描设备的缓慢移动，以便将照明光重新定向到所选择的潜在位置。扫描设备的这种机械移动花费相当多的时间，尤其是与通过使用电光或声光效应(诸如锥形衍射)来改变照明光图案所需的短时间相比。此外，机械容限会影响测量准确性。此外，如果通过伪造的方式选择了错误的潜在位置来重复测量序列，那么这种简单的解决方案将特别低效。最后，就光子预算而言，这不是优选的，因为粒子必须发射足够的光才能进行完整的测量序列。
技术实现思路
1、因此，目的是提供允许在样品区域中明确但高效地定位单个粒子的显微镜和方法。
2、上面提到的目的通过独立权利要求的主题得以实现。有利的实施例在从属权利要求和以下描述中定义。
3、单粒子定位显微镜包括光学系统，该光学系统被配置为用光图案的序列照亮样品区域，所述光图案具有适于使位于样品区域中的单个粒子发射检测光的照明光的空间不同分布。单粒子定位显微镜包括检测器，该检测器被配置为响应于照明光图案的序列来检测从样品区域发出的检测光的强度的序列。单粒子定位显微镜包括处理器，该处理器被配置为基于检测光的强度的序列来确定用于在样品区域中定位粒子的潜在位置的布置。处理器还被配置为使光学系统用至少一个后续光图案照亮样品区域，该至少一个后续光图案具有相对于多个潜在位置的布置不对称的照明光的空间分布。处理器被配置为使检测器响应于至少一个后续光图案而检测从样品区域发出的检测光的至少一个后续强度。处理器被配置为基于检测光的至少一个后续强度来决定多个潜在位置中的哪一个表示粒子在样品区域中的实际位置。
4、本文提出的显微镜适于区分多个粒子位置，除此之外这些粒子位置由于在粒子定位所基于的多个强度测量的序列中应用的照明光图案的对称性而无法区分。照明光图案的对称性出现在多个超分辨率定位方法中，诸如但不限于上面提到的基于锥形衍射的方法。而且，上面提到的minflux方法可以用用于定位单个粒子的光对称图案进行操作。在所有这些方法中，顺序照亮样品的光图案的对称性导致不仅一个位置，而是与响应于对称光图案的序列而测得的检测光强度的序列同等匹配的几个位置。多个潜在粒子位置之间的区分可以通过用至少一个附加的照明光图案照亮样品来实现，该至少一个附加的照明光图案被用作测试图案以解决定位模糊性。为了这个目的，选择测试图案的空间分布，使得该图案相对于由先前计算的粒子位置产生的布置具有不对称的形状。
5、所提出的解决方案可以仅通过一次附加测量来实现。此外，它不要求对通常用于激光扫描显微术中的扫描设备(诸如扫描镜)进行任何机械重新定位。因此，可以实现快速且轻便高效的定位。
6、例如，光学系统可以包括机械扫描设备，诸如上面提到的扫描镜，其可以移动以在样品之上扫描照明光。这允许对样品中的各个点进行扫描和成像。每个点对应于与光学系统的聚焦区域重合并且包括将借助于显微镜定位的单个发射体的特定样品区域。在这种配置中，处理器可以使光学系统用形成不对称测试图案的至少一个后续光图案照亮特定样品区域，而无需为这个目的使用扫描设备，因此不需要机械重新定位。
7、特别地，涉及扫描设备的物理以及因此缓慢移动以及针对特定潜在位置的多个测量序列的重复的非优选的解决方案尤其低效，如果该特定位置不是真正的粒子位置的话，反映了伪造的情况。相反，所提出的解决方案允许清楚地区分验证和伪造的情况。
8、根据要区分的潜在粒子位置，不同的光图案会导致类似的模糊性。本解决方案可以应用于由于它们的对称性而造成模糊性的所有种类的光图案。因此，可以针对特定情况采用不对称的测试图案。
9、使用测试图案的附加强度测量也可以用于增加定位过程的精度。换句话说，附加测量不限于模糊性识别。
10、此外，与测试测量之前的测量相比，可以在时间上缩短基于测试图案的附加强度测量和/或可以降低本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种单粒子定位显微镜(100)，包括：
2.根据权利要求1所述的单粒子定位显微镜(100)，其中所述光学系统(102)包括电光设备或声光设备(126)，其被配置为生成用于照亮所述样品区域(120)的所述光图案(124-1，124-2，124-3)的序列和所述至少一个后续光图案(524)。
3.根据前述权利要求中的任一项所述的单粒子定位显微镜(100)，其中所述光学系统(102)被配置为在所述样品区域(120)中形成来自所述照明光(110)的光分布并且移动所述光分布以在所述样品区域(120)中生成所述光图案(124-1，124-2，124-3；524)的序列。
4.根据权利要求3所述的单粒子定位显微镜(100)，其中所述光学系统(102)被配置为将所述光分布横向于光传播方向顺序地移位到不同的移位位置和/或将所述光分布绕平行于所述光传播方向的中心轴线顺序地旋转到不同的旋转位置，以在所述样品区域(120)中生成所述光图案(124-1，124-2，124-3)的序列。
5.根据权利要求3或4所述的单粒子定位显微镜(100)，其中所述光分
6.根据权利要求3或4所述的单粒子定位显微镜(100)，其中所述光分布包括至少两个强度最大值(236-1，238-1；236-2，238-2；236-3，238-3)和强度最小值(240-1，240-2，240-3)，所述至少两个强度最大值(236-1，238-1；236-2，238-2；236-3，238-3)相对于在所述强度最大值(236-1，238-1；236-2，238-2；236-3，238-3)之间延伸的中心对称轴线对称地相对，所述强度最小值(240-1，240-2，240-3)沿着所述中心对称轴线，所述强度优选地为零。
7.根据前述权利要求中的任一项所述的单粒子定位显微镜(100)，其中所述处理器(132)被配置为基于所述检测光(112)的所述强度(I1，I2，I3)的序列确定具有表示用于在所述样品区域(120)中定位所述粒子(122)的所述多个潜在位置(446a，446b，448a，448b)的多个极值的空间概率分布(444)。
8.根据权利要求7所述的单粒子定位显微镜(100)，其中所述处理器(132)被配置为从预先计算的表中根据检测到的所述强度(I1，I2，I3)的序列确定所述空间概率分布(444)。
9.根据权利要求7或8所述的单粒子定位显微镜(100)，其中所述处理器(132)被配置为基于所述空间概率分布(444)确定包括所述多个潜在位置(446a，446b，448a，448b)中的至少两个潜在位置的对称线(342)，并将所述后续光图案(524)的空间分布定义为相对于所述对称线(342)不对称。
10.根据前述权利要求中的任一项所述的单粒子定位显微镜(100)，其中所述处理器(132)被配置为基于在用所述后续光图案(524)照亮所述样品区域(120)之前检测到的所述强度(I1，I2，I3)的序列估计所述检测光(112)的后续强度(I4)并将估计的后续强度与检测到的后续强度(I4)进行比较以决定所述粒子(122)在所述样品区域(120)中的实际位置。
11.根据前述权利要求中的任一项所述的单粒子定位显微镜(100)，其中所述检测器(116)被配置为对单个光子进行计数以检测所述检测光(112)的所述强度(I1，I2，I3)的序列和所述后续强度(I4)。
12.一种用于在样品区域(120)中定位单个粒子(122)的方法，包括以下步骤：
13.根据权利要求12所述的方法，其中制备所述样品区域(120)以满足只有一个粒子(122)位于所述样品区域(120)中的单粒子定位条件。
14.根据权利要求13所述的方法，其中通过选择合适的粒子浓度来满足所述单粒子定位条件。
15.根据权利要求13所述的方法，其中通过粒子的光激活或光失活以保持所述粒子的大部分处于非发光状态来满足所述单粒子定位条件。
...【技术特征摘要】
1.一种单粒子定位显微镜(100)，包括：
2.根据权利要求1所述的单粒子定位显微镜(100)，其中所述光学系统(102)包括电光设备或声光设备(126)，其被配置为生成用于照亮所述样品区域(120)的所述光图案(124-1，124-2，124-3)的序列和所述至少一个后续光图案(524)。
3.根据前述权利要求中的任一项所述的单粒子定位显微镜(100)，其中所述光学系统(102)被配置为在所述样品区域(120)中形成来自所述照明光(110)的光分布并且移动所述光分布以在所述样品区域(120)中生成所述光图案(124-1，124-2，124-3；524)的序列。
4.根据权利要求3所述的单粒子定位显微镜(100)，其中所述光学系统(102)被配置为将所述光分布横向于光传播方向顺序地移位到不同的移位位置和/或将所述光分布绕平行于所述光传播方向的中心轴线顺序地旋转到不同的旋转位置，以在所述样品区域(120)中生成所述光图案(124-1，124-2，124-3)的序列。
5.根据权利要求3或4所述的单粒子定位显微镜(100)，其中所述光分布呈涡旋形或环形。
6.根据权利要求3或4所述的单粒子定位显微镜(100)，其中所述光分布包括至少两个强度最大值(236-1，238-1；236-2，238-2；236-3，238-3)和强度最小值(240-1，240-2，240-3)，所述至少两个强度最大值(236-1，238-1；236-2，238-2；236-3，238-3)相对于在所述强度最大值(236-1，238-1；236-2，238-2；236-3，238-3)之间延伸的中心对称轴线对称地相对，所述强度最小值(240-1，240-2，240-3)沿着所述中心对称轴线，所述强度优选地为零。
7.根据前述权利要求中的任一项所述的单粒子定位显微镜(100)，其中所述处理器(132)被配置为基于所述检测光(112)的所述强度(i1，i2，i3)的序列确定...
【专利技术属性】
技术研发人员：马库斯·迪巴，
申请(专利权)人：莱卡微系统CMS有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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