【技术实现步骤摘要】
本申请属于成纤维细胞分离培养，具体涉及一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法。
技术介绍
1、成纤维细胞是一种具有组织异质性的间充质细胞，通过产生复杂的细胞外基质，并通过生物物理和生化线索创造信号生态位，参与组织的动态平衡和疾病。皮肤成纤维细胞是成纤维细胞类群之一，作为细胞生物学与医学研究中的重要细胞系之一，其原代细胞主要来源于捐献者的完整皮肤组织，通过对完整皮肤组织使用胶原酶进行消化，使内皮细胞如成纤维细胞分离，接种于适宜培养基中进行培养，从而得到皮肤成纤维细胞。
2、现有皮肤成纤维细胞分离主要存在两种方法，一是组织块培养法，主要是将剪碎的皮肤组织直接铺于培养皿底部，或者皮肤组织经消化酶分散后将真皮组织与表皮分离，将真皮碎组织块贴壁后进行培养；二为酶消化培养法，将剪碎的皮肤组织用胶原酶消化直接得到成纤维细胞，或者经过分散酶和胰蛋白酶消化，然后将混合物过滤，对得到的细胞悬液进行培养，分离成纤维细胞。其中，组织块培养法利用组织边缘细胞缓慢迁移的过程，培养分离成纤维细胞时，由于在2d培养平面中接触面积仅限组织的边缘部位，所以整体细胞分离速度较慢；组织中的结缔组织部分并未被分散，限制了更多细胞的快速富集，传统组织块培养法，细胞爬出组织块时间为最快4～6天，最慢1～2周；细胞首次传代时间为21～24天，再次传代时间为3～8天，纯化所需时间久，增殖能力弱；此外，由于表皮及真皮层紧密结合，组织块往往带有表皮部分，分离出的原代成纤维细胞中往往混有表皮细胞团，难以进行后续的分离纯化，对于成纤维细胞株的纯度影响较大，干扰基于细胞的实
3、此外，研究表明迁延不愈或愈合缓慢性质的供体的皮肤组织，如中老年等供体组织中含有更多的细胞外基质，较幼儿组织含有更多的ⅲ型胶原而少ⅰ型胶原，交联程度和机械强度更高，所以一般胶原酶分离法对于该类组织消化适用性较低。
技术实现思路
1、1.拟解决的技术问题
2、本申请针对酶消化迁延不愈或愈合缓慢性质的供体的皮肤组织时，胶原酶适用性较低、初代细胞培养过程缓慢等问题之一，提供了一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，通过添加趋化因子，与组织区域浓度的成纤维细胞的趋化因子形成梯度差，促进成纤维细胞快速从组织块爬出，增殖从而快速形成原代细胞培养体系，使用本申请的非酶消化分离培养方法制备的成纤维细胞作为细胞系的种子细胞，进行建系，可获得数量多、纯度较高且制备方便的皮肤成纤维细胞系，用于科学实验研究，成活率高。
3、2.技术方案
4、为了解决上述问题，本申请所采用的技术方案如下：
5、本申请提供了一种皮肤组织运输液，该皮肤组织运输液包括磷酸缓冲盐溶液(pbs)，和hsa(人血白蛋白)或bsa(牛血白蛋白)，磷酸缓冲盐溶液(pbs)的渗透压为280～320mosm/kg·h2o，ph为7.1～7.4，hsa(人血白蛋白)或bsa(牛血白蛋白)的终浓度为0.2％～1％，其中：磷酸缓冲盐溶液(pbs)作为溶剂，hsa或bsa在缓冲体系中作为皮肤组织的稳定剂，hsa或bsa的添加提高了组织运输液中蛋白质的浓度，对皮肤组织边缘的各种蛋白可以起到一定的保护作用，延长了组织的保存时间或者提高组织分离后细胞的成活率。
6、进一步地，上述一种皮肤组织运输液，该皮肤组织运输液包括磷酸缓冲盐溶液(pbs)，和hsa(人血白蛋白)。
7、进一步地，上述hsa的终浓度为1％。
8、进一步地，上述一种皮肤组织运输液，该皮肤组织运输液包括磷酸缓冲盐溶液(pbs)，和bsa(牛血白蛋白)。
9、进一步地，上述bsa的终浓度为1％。
10、本申请还提供了一种皮肤组织消毒方法，该方法是以聚维酮碘和乙醇作为消毒剂，取代传统的双抗(青霉素-链霉素)消毒方法，操作简单且效果稳定，同时避免了抗生素的使用所造成的干扰，具体包括：
11、取皮肤组织，使用pbs清洗，可多次清洗，如两次；
12、将清洗后的皮肤组织置于有效成分为5％聚维酮碘的消毒液中，涮洗3～5min，时间根据组织块大小进行调节，完成消毒目的即可；
13、使用pbs清洗皮肤组织，可多次清洗，如两次；
14、将皮肤组织置于75％乙醇中，浸泡3～5min，过度消毒会损失细胞活率。
15、进一步地，上述乙醇浸泡时间为4min。
16、本申请还提供了一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，包括：
17、s1，将消毒后的皮肤组织浸入胶原酶溶液中，剪碎并消化；
18、s2，加入dmem基础培养基中止消化，离心取沉淀，获得皮肤成纤维细胞。
19、进一步地，上述一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，还包括：
20、上述s1中，将消毒后的皮肤组织浸入胶原酶溶液中还可以包括前处理，使用中性蛋白酶溶液消化消毒后的皮肤组织，消化后去除表皮组织；将消化后去除表皮组织后的真皮组织浸入胶原酶溶液中。
21、进一步地，上述一种皮肤成纤维细胞的酶消化分离培养方法，还包括：
22、s3，重悬皮肤成纤维细胞，接种在dmem完全培养基中培养，获得原代培养的皮肤成纤维细胞。
23、进一步地，上述s3中，重悬皮肤成纤维细胞包括使用dmem完全培养基或dmem高糖基础培养基重悬。
24、进一步地，上述s3中，原代培养过程添加有成纤维细胞生长因子fgf和/或glutamax。
25、进一步地，上述s3中，原代培养过程添加有成纤维细胞生长因子fgf和glutamax。
26、进一步地，上述s3中，fgf的终浓度为40～60ng/ml，glutamax的终浓度为1～3mm。
27、进一步地，上述s3中，fgf的终浓度为50ng/ml，glutamax的终浓度为2mm。
28、进一步地，上述s3中，培养的容器可使用亲水镀膜工艺相关细胞容器进行培养，增加细胞贴壁的速度、贴壁程度，有利于细胞成活。
29、进一步地，上述中性蛋白酶为中性蛋白酶af。
30、进一步地，上述中性蛋白酶af溶液为含钙镁离子的hank's平衡盐溶液(hbss)配制的2dmc u/ml中性蛋白酶af溶液。
31、进一步地，上述中性蛋白酶af溶液中含有庆大霉素80u/ml或者1×的双抗(青霉素-链霉素)。
32、进一步地，上述中性蛋白酶溶液消化的消化条件为2～8℃过夜消化12～20h。
33、进一步地，上述中性蛋白酶溶液消化的消化条件为4℃消化12～20h。
34、进一步地，上述s1中，胶原酶溶液含有终体积为0.2％～1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，其特征在于，所述皮肤组织包括来源于具有伤口迁延不愈或愈合缓慢性质的供体的皮肤组织。
3.根据权利要求1或2所述的一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，其特征在于，所述将消毒后的皮肤组织剪碎还可以包括前处理，使用中性蛋白酶溶液消化消毒后的皮肤组织，消化后去除表皮组织；将消化后去除表皮组织后的真皮组织剪碎。
4.根据权利要求3所述的一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，其特征在于，所述中性蛋白酶溶液为HBSS配制的2DMC U/mL中性蛋白酶AF溶液；所述中性蛋白酶溶液消化的消化条件为2～8℃过夜消化12～20h。
5.根据权利要求1-4所述的一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，其特征在于，所述细胞培养容器经过亲水处理或者铺设有FNC coating MIX。
6.根据权利要求5所述的一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，其特征在于，所述成纤维细胞的趋化因子包括
7.根据权利要求6所述的一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，其特征在于，所述成纤维细胞的趋化因子的浓度为1～100ng/mL。
8.根据权利要求7所述的一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，其特征在于，所述成纤维细胞的趋化因子包括FGF2；所述FGF2的浓度为50ng/mL。
9.根据权利要求1-8任一所述的一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，其特征在于，所述消毒包括如下步骤：
10.根据权利要求9所述的一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，其特征在于，所述皮肤组织在消毒前保存于皮肤组织运输液，所述皮肤组织运输液包括磷酸缓冲盐溶液，和HSA或BSA。
11.一种皮肤成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
12.一种皮肤组织运输液，其特征在于，所述皮肤组织运输液包括磷酸缓冲盐溶液，和HSA或BSA，其中：
13.一种皮肤组织消毒方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，其特征在于，所述皮肤组织包括来源于具有伤口迁延不愈或愈合缓慢性质的供体的皮肤组织。
3.根据权利要求1或2所述的一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，其特征在于，所述将消毒后的皮肤组织剪碎还可以包括前处理，使用中性蛋白酶溶液消化消毒后的皮肤组织，消化后去除表皮组织；将消化后去除表皮组织后的真皮组织剪碎。
4.根据权利要求3所述的一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，其特征在于，所述中性蛋白酶溶液为hbss配制的2dmc u/ml中性蛋白酶af溶液；所述中性蛋白酶溶液消化的消化条件为2～8℃过夜消化12～20h。
5.根据权利要求1-4所述的一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，其特征在于，所述细胞培养容器经过亲水处理或者铺设有fnc coating mix。
6.根据权利要求5所述的一种皮肤成纤维细胞的非酶消化分离培养方法，其特征在于，所述成纤维细胞的趋...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨昊，周伸奥，周丽，张琴，
申请(专利权)人：椎元医学技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。