【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学领域中的基因治疗领域。具体而言，本专利技术涉及一种靶向plin2基因的短反义寡核苷酸和rnai试剂，以及包含所述rnai试剂的组合物。本专利技术还涉及所述短反义寡核苷酸和rnai试剂用于治疗或预防肝脏脂代谢异常相关疾病的用途。
技术介绍
1、随着发病率的不断攀升，非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liverdisease,nafld)已成为世界性的健康问题，累及全球1/4人口，威胁着全球近二十亿人的生命健康。当患者肝脏中的脂肪含量超过肝脏总质量的5％时，且患者每周饮酒量低于140g，即被诊断为nafld。nafld包括无进展的单纯脂肪变性和进展性的非酒精性脂肪肝炎(nash)。如果不加以及时的干预，nash会逐步进展到肝脏纤维化、肝硬化和肝癌，并最终造成患者死亡。
2、nafld的发病过程非常复杂。肥胖、药物、营养不良等均是nafld的重要诱因。另外，环境因素和遗传背景也会影响nafld的病程发展，并导致不同的患者对特定治疗药物的响应产生差异。例如，目前在大量研究中显示pnpla3(patatin-like phospholipase domaincontaining 3protein)i148m变体为与nafld最为相关的一个突变，有50％的nafld病人至少携带一个突变的pnpla3 148m等位基因。有报道pnpla3 i148m变体可能诱导了新合成的甘油三酯的肝脏保留，及影响了肝脏极低密度脂蛋白的分泌，从而影响了血浆甘油三酯水平。有研究认为，在pnpla3 i14
3、当下nafld药物的临床前实验绝大部分仅考虑了饮食这一因素，而忽略了在实际情况中病人存在的不同遗传背景。另外，当使用试验动物进行药物的前期筛选时，需要从“对试验动物有效”上行(upgoing)到“对人有效”；或当探讨已有药物的其他用途时，需要进行动物层面的大量试验，从“对人有效”下行(downgoing)到“对试验动物有效”。由于试验动物的基因与人的基因在种属间存在差异，这种“迁移”存在障碍，耗费大量的人力物力和动物的生命。这可能也是近年来许多nafld治疗药物在动物模型中效果很好，但是却未能顺利通过临床试验的重要原因。
4、目前对nafld的一线治疗方法主要包括通过饮食干预、并结合运动来减轻体重。对于这些疗法，患者不可避免地存在依从性差等诸多问题。至今为止，全球范围内仅genfit公司的elafibranor这一款药物在印度获批上市，其为一种ppar激动剂。当前尚无nafld治疗药物通过美国食品药品监督管理局(fda)或欧洲药品管理局(ema)的上市许可，可见针对nafld治疗药物仍然存在巨大的临床需求。
5、探寻nafld疾病的机理共同点设计治疗药物，将有望解决药物现有的问题。
6、作为肝脏细胞储存脂肪的重要场所，脂滴(lipid droplet)的积累是nafld临床共有的早期特征。通过在脂滴稳态领域深入多年的研究，专利技术人鉴定并解析了一系列参与脂滴(lipid droplet,ld)稳态调控的关键蛋白和信号通路，发现脂滴包被蛋白2(perilipin-2，plin2)是肝细胞中重要的脂滴保护蛋白，其蛋白水平在nafld的发病过程中显著提高，展现出强烈的临床相关性。在ld积累的情况下，plin2表达随之增加，从而抑制脂肪甘油三酯脂酶(adipose triglycerides lipase,atgl)进入ld核心，使脂肪无法正常分解，继而促进了脂肪变性。
7、对于plin2与nafld的关系，与上述临床相关性对应，有报道plin2基因敲除小鼠能够抵抗肥胖或高脂饮食导致的nafld，展现出健康的生理指标和运动能力。
8、目前尚没有建立一种靶向于plin2相关蛋白或通路的、用于肝脏脂代谢异常相关疾病的治疗方法。需要深入研究靶向于plin2相关蛋白或通路的药物如何设计，希望该药物在生物体内缓解或纠正肝脏脂代谢异常，在给药过程中安全及无副作用，特别是希望治疗药物在受试者具有pnpla3 i148m的遗传背景时仍然有效。
技术实现思路
1、作为新药的开发方向，专利技术人设想通过降低肝细胞中plin2的蛋白水平而降低肝脏中的脂肪含量，尤其是能够治疗肝脏脂代谢异常相关疾病如nafld。
2、专利技术人在体外培养的肝细胞中成功筛选出效率高、脱靶少的针对人与小鼠的plin2基因的短反义寡核苷酸对，所述短反义寡核苷酸对在人与小鼠中靶向于plin2基因的相同位置，且人与小鼠中仅有1或2个碱基的区别。通过试验证实，包含上述对中的人短反义寡核苷酸的sirna降低了高脂饮食饲喂的人源化小鼠的肝脏中的脂肪沉积。
3、在此基础上，对短反义寡核苷酸进行了乙酰半乳糖胺修饰，获得的galnac-plin2短反义寡核苷酸具有肝脏递送靶向性和增强的稳定性。
4、试验证实galnac-plin2短反义寡核苷酸在野生型小鼠和具有人plin2基因的人源化小鼠中能够降低肝脏-体重比，降低肝脏脂肪含量，显著降低nafld评分，降低肝损伤以及炎症和纤维化，获得了显著的肝脏脂肪沉积治疗效果。另外，在将galnac-plin2短反义寡核苷酸给予小鼠时，未引起免疫反应以及器官损伤等不良反应，具有良好的安全性。
5、由此，专利技术人提供了靶向plin2的短反义寡核苷酸，特别涉及使用该短反义寡核苷酸来降低肝脏脂质沉积、治疗nafld的方法。特别地，专利技术人提供了galnac-plin2短反义寡核苷酸，及其作为nafld预防或治疗药物的用途，及纠正其他病理情况下的肝脏脂肪变性以及其他组织的脂质积累的用途，由此完成了本专利技术。
6、第一方面，本专利技术提供一种短反义寡核苷酸，其中所述短反义寡核苷酸靶向编码plin2蛋白的核苷酸。
7、在第一方面的具体实施方案中，所述短反义寡核苷酸包含选自seq id nos:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20的核苷酸序列，或与其相差1或2个核苷酸的核苷酸序列；或由选自seq id nos:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20的核苷酸序列组成，或由与其相差1或2个核苷酸的核苷酸序列组成。
8、第二方面，本专利技术提供包含第一方面的短反义寡核苷酸的rnai试剂。
9、在第二方面的具体实施方案中，所述rnai试剂包含正义链和反义链，所述反义链为第一方面的靶向plin2基因的短反义寡核苷酸，并且所述正义链与所述短反义寡核苷酸至少部分互补。
10、在第二方面的具体实施方式中，所述正义链和反义链优选具有选自下列的修饰：
11、(a)3’末端n-乙酰半乳糖胺(galnac)修饰，即对脱唾液酸糖蛋白受体具有亲和力的n-乙酰半乳糖胺(galnac修饰)，以实现靶向于肝脏的递送；
12、(b)糖环修饰，如利用2’-氟代(2’-fluoro,2’-f本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.短反义寡核苷酸，其靶向编码PLIN2蛋白的核苷酸序列，所述PLIN2为人PLIN2蛋白(SEQ ID NO:35)或小鼠PLIN2蛋白(SEQ ID NO:33)。
2.权利要求1所述的短反义寡核苷酸序列，其为如下(i)或(ii)：
3.用于抑制人PLIN2基因或鼠Plin2基因的表达的RNAi试剂，其包含：
4.权利要求4所述的RNAi试剂，其中所述正义链和反义链具有在19个核苷酸长度上互补。
5.权利要求3或4所述的RNAi试剂，其包含：
6.项3至5中任一项所述的RNAi试剂，其中所述正义链或反义链包含一种或多种选自下组的修饰：
7.权利要求3至6中任一项所述的RNAi试剂，其具有如表1、表3或表4中所示的正义链和反义链对。
8.一种组合物，其包含
9.权利要求1或2所述的短反义寡核苷酸，或权利要求3至7中所述的RNAi试剂在制备药物中的用途，所述药物用于通过抑制受试者中PLIN2基因的表达来治疗或预防所述受试者中与肝脏脂代谢异常相关的疾病，特别是非酒精性脂肪肝病(NAFLD
10.权利要求9所述的用途，其中所述受试者具有PNPLA3 I148M突变。
...【技术特征摘要】
1.短反义寡核苷酸，其靶向编码plin2蛋白的核苷酸序列，所述plin2为人plin2蛋白(seq id no:35)或小鼠plin2蛋白(seq id no:33)。
2.权利要求1所述的短反义寡核苷酸序列，其为如下(i)或(ii)：
3.用于抑制人plin2基因或鼠plin2基因的表达的rnai试剂，其包含：
4.权利要求4所述的rnai试剂，其中所述正义链和反义链具有在19个核苷酸长度上互补。
5.权利要求3或4所述的rnai试剂，其包含：
6.项3至5中任一项所述的rnai试剂，其中所述正义链或反义...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱健，王尧，刘敏，张延松，林思远，杨琪，李锦华，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：
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