【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种诱导性多能干细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
1、随着细胞研究的发展，成体细胞可以通过重编程改变基因表达谱，重新获得多能干性。早期体细胞重编程的方法主要有体细胞核移植和细胞融合，但这两种方法仍然存在发育异常、免疫缺陷和伦理问题等问题。2006年，takahashi和yamanaka筛选出4个转录因子oskm：oct4、sox2、klf4、c-myc组合，可将终末分化的体细胞重编程为具有胚胎干细胞特性的ipscs(诱导性多能干细胞，inducedpluripotent stem cells)，极大拓展了干细胞技术在临床医学上的应用潜力。现在，ipscs的研究应用体系日趋成熟，但也面临着重编程效率低、重编程机制不清楚、重编程细胞异质性强和安全性问题等缺陷。
2、目前，国际上多个实验室已经开发出多种重编程方法，根据重编程载体分类，可以大致分为以下四类：(1)病毒法：其中包括了基因组随即插入型病毒载体(慢病毒)和非基因组插入载体(仙台病毒)，该类方法的缺点在于基因组的随即插入所带来的潜在风险，或者冗长的病毒稀释过程带来的不变。(2)dna法：其中包括piggy bac、sleeping beaμty以及episomal在内的多种质粒类型，这类方法的特征为重编程效率低。(3)rna法和蛋白质法：这类方法操作过程复杂，在工业应用实用性较差。(4)化合物小分子法：这是目前应用越来越广泛的一种重编程方法，但其重编程效率存在较大的个体差异。
3、然而，目前前3种方法在诱导过程中均使用含有血清成
4、因此，亟需提供一种高效、安全、简单的扩增诱导性多能干细胞的方法，避免基因整合的危险，大大提高诱导性多能干细胞的克隆形成率。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种诱导性多能干细胞及其制备方法和应用，解决了现有制备诱导性多能干细胞的方法存在的安全性差，重编程效率低，操作复杂等问题，使用非整合型质粒重编程人来源的cd34+细胞成功诱导形成了质粒非整合型诱导性多能干细胞，得到的诱导性多能干细胞克隆形成率以及细胞核型的正确率显著提高。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种制备诱导性多能干细胞的方法，所述方法包括：使用非整合质粒对cd34+细胞进行细胞核转染，转染后在重编程完全培养基中进行培养和传代，所述重编程完全培养基含有胎盘多肽、乐卡地平和去氢骆驼蓬碱。
4、本专利技术使用非整合型质粒重编程人来源的cd34+细胞，成功诱导形成了质粒非整合型诱导性多能干细胞，所产生的诱导性多能干细胞无外源基因、无病毒插入，避免了基因整合的危险，具有高效性和安全性，方法具有简单性和重复性，制备诱导性多能干细胞过程中添加了胎盘活性多肽、乐卡地平(lercanidipine)和去氢骆驼蓬碱(特异性酪氨酸磷酸化调节激酶抑制剂)，并精准控制了胎盘活性多肽、乐卡地平和去氢骆驼蓬碱的添加比例，大大提高了人外周血来源的cd34+细胞的诱导性多能干细胞的克隆形成率以及细胞核型的正确率。
5、优选地，所述胎盘多肽、乐卡地平和去氢骆驼蓬碱的质量比为(2-10):5:5。
6、上述2-10中的具体点值可以选择2、3、4、5、6、7、8、9、10等。
7、优选地，所述单个核细胞的来源包括人、大鼠、小鼠、牛或猪中的任意一种。
8、优选地，所述使用非整合质粒对cd34+细胞进行细胞核转染包括将重编程基因用非整合型附着体载体导入cd34+造血干细胞。
9、优选地，所述重编程基因包括oct4、sox2、nanog或ssea-1中任意一种或至少两种的组合。
10、优选地，所述非整合型附着体载体包括episomal质粒载体。
11、优选地，所述培养的时间为20-30天。
12、优选地，所述传代为细胞汇合度达到80％-90％时进行传达，所述传代的代数为8-10代。
13、上述20-30天中的具体点值可以选择20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天等。
14、上述80％-90％中的具体点值可以选择80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％等。
15、上述8-10代中的具体点值可以选择8代、9代、10代等。
16、第二方面，本专利技术提供了一种诱导性多能干细胞，所述诱导性多能干细胞由第一方面所述的制备诱导性多能干细胞的方法制备得到。
17、第三方面，本专利技术提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有第二方面所述的诱导性多能干细胞。
18、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
19、(1)本专利技术使用非整合型质粒重编程人来源的cd34+细胞，成功诱导形成了质粒非整合型诱导性多能干细胞，所产生的诱导性多能干细胞无外源基因、无病毒插入，避免了基因整合的危险，具有高效性和安全性，方法具有简单性和重复性，为下一步建立更多血液系统疾病诱导性多能干细胞的研究奠定了基础；
20、(2)本专利技术方法制备诱导性多能干细胞过程中添加了胎盘活性多肽、乐卡地平和去氢骆驼蓬碱，并精准控制了胎盘活性多肽、乐卡地平和去氢骆驼蓬碱的添加比例，大大提高了人外周血来源的cd34+细胞的诱导性多能干细胞的克隆形成率以及细胞核型的正确率。
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1.一种制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胎盘多肽、乐卡地平和去氢骆驼蓬碱的质量比为(2-10):5:5。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述单个核细胞的来源包括人、大鼠、小鼠、牛或猪中的任意一种。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述使用非整合质粒对CD34+细胞进行细胞核转染包括将重编程基因用非整合型附着体载体导入CD34+造血干细胞。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述重编程基因包括OCT4、SOX2、NANOG或SSEA-1中任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述非整合型附着体载体包括Episomal质粒载体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养的时间为20-30天。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述传代为细胞汇合度达到80％-90％时进行传达，所述传代的代数为
9.一种诱导性多能干细胞，其特征在于，所述诱导性多能干细胞由权利要求1-8中任一项所述的制备诱导性多能干细胞的方法制备得到。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求9所述的诱导性多能干细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胎盘多肽、乐卡地平和去氢骆驼蓬碱的质量比为(2-10):5:5。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述单个核细胞的来源包括人、大鼠、小鼠、牛或猪中的任意一种。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述使用非整合质粒对cd34+细胞进行细胞核转染包括将重编程基因用非整合型附着体载体导入cd34+造血干细胞。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述重编程基因包括oct4、sox2、nanog或ssea-1中任意一...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏伟，嵐山芮，许超，
申请(专利权)人：广州瑞铂茵健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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