【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及代谢工程及基因工程技术生产领域，尤其是一种尿嘧啶核苷酸生产菌株及其定向改造方法与应用。
技术介绍
1、尿嘧啶核苷酸(uridine5’monophosphate，ump)在农业、畜牧业及医药领域中均有着广泛的应用。现如今，随着人们对尿嘧啶核苷酸功能研究的逐渐深入，其市场需求还在不断扩大。
2、当前工业化生产尿嘧啶核苷酸的方式主要是核酸水解法，得力于该方法具有原料足，成本低，生产条件温和等优点，但同时也存在酶解不完全、反应效率较低、分离困难、单核苷酸种类有限及纯度低等问题。随着合成生物学的迅速发展，越来越多研究者已经通过构建微生物细胞工厂发酵生产许多天然产物和化学品来逐渐代替化学法及水解法。现阶段微生物发酵法合成尿嘧啶核苷酸主要为酶催化及全细胞催化法，上述两种方法都需要底物中添加大量的前体物乳清酸，生产成本较高以至于无法实现工业化。因此，现阶段亟需一株可从头高效合成尿嘧啶核苷酸的菌株及工艺。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种尿嘧啶核苷酸生产菌株。
2、本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述尿嘧啶核苷酸生产菌株的定向改造方法。
3、本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述尿嘧啶核苷酸生产菌株的应用。
4、为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：
5、一种尿嘧啶核苷酸生产菌株，为菌株 e.coliump11，是利用定向改造方法在出发菌株
6、优选的，上述尿嘧啶核苷酸生产菌株，所述出发菌株e.coli ora12为cn202410290893.1（一种乳清酸生产菌株及其定向改造方法与应用）中菌株e.coli ora12。
7、优选的，上述尿嘧啶核苷酸生产菌株，所述定向改造方法是利用crispr/cas9基因编辑技术完全在出发菌株 e.coliora12染色体基因组上进行改造。
8、优选的，上述尿嘧啶核苷酸生产菌株，所述usha基因的核苷酸序列如序列表seqid no.1所示；nagd基因的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示；sure基因的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示；yjjg基因的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示；ygdh基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示；pykf基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示。
9、优选的，上述尿嘧啶核苷酸生产菌株，在ylbe位点上整合经密码子优化后的野生型枯草芽孢杆菌b.subtilis 168核糖磷酸焦磷酸激酶基因prs，并用启动子pbba_j23108调控，并于yeep位点再次整入；经密码子优化后的prs基因的核苷酸序列如序列表seq id no.7所示，启动子pbba_j23108的核苷酸序列如序列表seq id no.8所示。
10、优选的，上述尿嘧啶核苷酸生产菌株，在ilvg位点上整合野生型枯草芽孢杆菌 b.subtilis168乳清酸核苷单磷酸脱羧酶基因 pyrf和乳清酸核糖基转移酶基因 pyre，并用启动子pbba_j23100调控；乳清酸核苷单磷酸脱羧酶基因和乳清酸核糖基转移酶基因 pyrf- pyre的核苷酸序列如序列表seq id no.9所示；所述启动子pbba_j23100的核苷酸序列如序列表seq id no.10所示。
11、优选的，上述尿嘧啶核苷酸生产菌株，在yjit位点上串联整合磷酸abc转运蛋白基因pstc、psta、pstb，并用同一个启动子pbba_j23108调控；磷酸abc转运蛋白基因pstc-psta-pstb的核苷酸序列如序列表seq id no.11所示。
12、优选的，上述尿嘧啶核苷酸生产菌株，用大肠杆菌鞭毛细丝结构蛋白基因flic的启动子pflic替换尿苷酸激酶基因pyrh的天然启动子；所述尿苷酸激酶基因pyrh的核苷酸序列如序列表seq id no.12所示，所述启动子pflic的核苷酸序列如序列表seq id no.13所示，所述尿苷酸激酶基因pyrh的天然启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.14所示。
13、上述尿嘧啶核苷酸生产菌株的定向改造方法，具体步骤如下：
14、（1）在 e.coliora12基因组上先后敲除usha基因（gene id: 947331）、nagd基因（gene id: 945283）、sure基因（gene id: 947211）、yjjg基因（gene id: 948899）和ygdh基因（gene id: 947266）以阻断ump到尿苷和尿嘧啶的降解途径；敲除pykf基因（gene id:946179）以缩减碳代谢流向tca循环，提高转化率；
15、（2）在ylbe和yeep位点上先后整合经密码子优化后的野生型枯草芽孢杆菌 b.subtilis168核糖磷酸焦磷酸激酶基因prs（gene id: 936985），并用启动子pbba_j23108调控，异源引入且双拷贝核糖磷酸焦磷酸激酶基因prs，加强prpp合成；
16、（3）在 ilvg位点上整合野生型枯草芽孢杆菌 b.subtilis168乳清酸核苷单磷酸脱羧酶基因 pyrf(gene id: 935960)和乳清酸核糖基转移酶基因 pyre(gene id: 936714)，并用启动子pbba_j23本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种尿嘧啶核苷酸生产菌株，其特征在于：是利用定向改造方法在出发菌株E.coliOra12的基础上进行进一步改造获得的，具体为：在E.coli Ora12基因组上敲除了ushA基因、nagD基因、surE基因、yjjG基因、ygdH基因和pykF基因,异源引入枯草芽孢杆菌B.subtilis 168中核糖磷酸焦磷酸激酶基因prs、乳清酸核苷单磷酸脱羧酶基因pyrF和乳清酸核糖基转移酶基因pyrE，过表达磷酸ABC转运蛋白基因pstC、pstA、pstB，并动态调控尿苷酸激酶基因pyrH。
2.根据权利要求1所述的尿嘧啶核苷酸生产菌株，其特征在于：所述定向改造方法是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术完全在出发菌株E.coli Ora12染色体基因组上进行改造。
3.根据权利要求1所述的尿嘧啶核苷酸生产菌株，其特征在于：所述ushA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；nagD基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；surE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；yjjG基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.4所
4.根据权利要求1所述的尿嘧啶核苷酸生产菌株，其特征在于：在ylbE位点上整合经密码子优化后的野生型枯草芽孢杆菌B.subtilis 168核糖磷酸焦磷酸激酶基因prs，并用启动子PBBa_J23108调控，并于yeeP位点再次整入；经密码子优化后的prs基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示，启动子PBBa_J23108的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示。
5.根据权利要求1所述的尿嘧啶核苷酸生产菌株，其特征在于：在ilvG位点上整合野生型枯草芽孢杆菌B.subtilis 168乳清酸核苷单磷酸脱羧酶基因pyrF和乳清酸核糖基转移酶基因pyrE，并用启动子PBBa_J23100调控；乳清酸核苷单磷酸脱羧酶基因和乳清酸核糖基转移酶基因pyrF-pyrE的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示；所述启动子PBBa_J23100的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示；在yjiT位点上串联整合磷酸ABC转运蛋白基因pstC、pstA、pstB，并用同一个启动子PBBa_J23108调控；磷酸ABC转运蛋白基因pstC-pstA-pstB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示。
6.根据权利要求1所述的尿嘧啶核苷酸生产菌株，其特征在于：用大肠杆菌鞭毛细丝结构蛋白基因fliC的启动子PfliC替换尿苷酸激酶基因pyrH的天然启动子；所述尿苷酸激酶基因pyrH的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.12所示，所述启动子PfliC的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示；所述尿苷酸激酶基因pyrH的天然启动子的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.14所示。
7.权利要求1-6之一所述尿嘧啶核苷酸生产菌株的定向改造方法，其特征在于：具体步骤如下：
8.权利要求1-6之一所述尿嘧啶核苷酸生产菌株在发酵生产尿嘧啶核苷酸方面的应用。
9.根据权利要求8所述的尿嘧啶核苷酸生产菌株的应用，其特征在于：使用摇瓶发酵生产尿嘧啶核苷酸，具体步骤如下：
10.根据权利要求9所述的尿嘧啶核苷酸生产菌株的应用，其特征在于：所述种子活化及培养中采用的斜面培养基为：葡萄糖2 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，氯化钠2.5g/L，KH2PO4 1.0 g/L，MgSO4 0.2 g/L，琼脂粉25%，其余为水，pH 7.0-7.2；种子培养基为：酵母粉8 g/L，蛋白胨2.0 g/L，(NH4)2SO4 2.0 g/L, KH2PO43.0 g/L，VB1 、VB3、VB5、VB12各2 mg/L，VH1 mg/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，钼酸铵0.32 mg/L，硼酸4.5 mg/L，CoCl2·6H2O 1.6 mg/L，其余为水；所述发酵培养中采用的发酵培养基为：酵母粉10 g/L,(NaPO3)63 g/L，柠檬酸2g/L，(NH4)2SO4 2.5 g/L，KH2PO410.0 g/L，MgSO4·7H2O 2.0 g/L，FeSO4·7H2O 40 mg/L，VB1 1 mg/L，VB3 1 mg/L，VB5 1 mg/L，VB12 1 mg/L，VH 0.1 mg/L，钼酸铵0.32 mg/L，硼酸4.5 mg/L，CoCl2·6H2O 1.6 mg/L，苯酚红2%,其余为水。...
【技术特征摘要】
1.一种尿嘧啶核苷酸生产菌株，其特征在于：是利用定向改造方法在出发菌株e.coliora12的基础上进行进一步改造获得的，具体为：在e.coli ora12基因组上敲除了usha基因、nagd基因、sure基因、yjjg基因、ygdh基因和pykf基因,异源引入枯草芽孢杆菌b.subtilis 168中核糖磷酸焦磷酸激酶基因prs、乳清酸核苷单磷酸脱羧酶基因pyrf和乳清酸核糖基转移酶基因pyre，过表达磷酸abc转运蛋白基因pstc、psta、pstb，并动态调控尿苷酸激酶基因pyrh。
2.根据权利要求1所述的尿嘧啶核苷酸生产菌株，其特征在于：所述定向改造方法是利用crispr/cas9基因编辑技术完全在出发菌株e.coli ora12染色体基因组上进行改造。
3.根据权利要求1所述的尿嘧啶核苷酸生产菌株，其特征在于：所述usha基因的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示；nagd基因的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示；sure基因的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示；yjjg基因的核苷酸序列如序列表seq idno.4所示；ygdh基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示；pykf基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示。
4.根据权利要求1所述的尿嘧啶核苷酸生产菌株，其特征在于：在ylbe位点上整合经密码子优化后的野生型枯草芽孢杆菌b.subtilis 168核糖磷酸焦磷酸激酶基因prs，并用启动子pbba_j23108调控，并于yeep位点再次整入；经密码子优化后的prs基因的核苷酸序列如序列表seq id no.7所示，启动子pbba_j23108的核苷酸序列如序列表seq id no.8所示。
5.根据权利要求1所述的尿嘧啶核苷酸生产菌株，其特征在于：在ilvg位点上整合野生型枯草芽孢杆菌b.subtilis 168乳清酸核苷单磷酸脱羧酶基因pyrf和乳清酸核糖基转移酶基因pyre，并用启动子pbba_j23100调控；乳清酸核苷单磷酸脱羧酶基因和乳清酸核糖基转移酶基因pyrf-pyre的核苷酸序列如序列表seq id no.9所示；所述启动子pbba_j23100的核苷酸序列如序列表seq id no.10所示；在yjit位点上串联整合磷酸abc转...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐庆阳，李长庚，闫子宽，范文静，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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