【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化，涉及一种烯还原酶突变体，其编码核酸分子、重组载体、重组细胞，以及该烯还原酶突变体的制备方法和在制备( r)-香茅醛中的应用。
技术介绍
1、( r)-香茅醛是合成重要香料l-薄荷醇的关键前体，也可用于合成羟基香茅醛和香茅醇酯等香料，广泛应用于食品、饮料、日用精细化工产品。目前工业上主要采用化学催化方法合成( r)-香茅醛，如日本高砂(takasago)公司专利技术的手性binap-rh+配位催化剂，但存在金属配体催化剂设计难，反应条件严苛，( r)-香茅醛的光学纯度不高等问题。通过生物催化法合成( r)-香茅醛，即由烯还原酶介导的对映归一性催化( e/z)-柠檬醛合成( r)-香茅醛技术具有工艺简单、反应条件温和、符合原子经济性、绿色环保的优点，极具应用价值。
2、专利技术专利cn113337450b公开了热带假丝酵母( candida tropicalis)来源的烯还原酶hp3，催化转化( e/z)-柠檬醛合成( r)-香茅醛反应20小时转化率达到99%以上，但 e.e.值仅为95.4%，仍有提升空间。
3、现有
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种催化性能显著提升的烯还原酶，从而解决现有烯还原酶催化合成( r)-香茅醛技术存在的产品生产效率不高、光学纯度不高的问题。
2、具体地，本专利技术以来源于维斯假丝酵母菌( candida viswanathii)的野生型烯还原酶 cvdh( candida viswanathiidehydrogenase)作为原始序列（其氨基酸序列如seq idno: 2所示，核苷酸序列如seq id no: 1所示），对其进行定向进化，从而得到在催化性能方面显著改善的烯还原酶突变体 cvdh-a181r。
3、在第一方面，本专利技术提供一种催化活性提高的烯还原酶突变体，其相对于seq idno: 2所示的野生型烯还原酶 cvdh，第181位的氨基酸由丙氨酸突变为精氨酸，该烯还原酶突变体命名为 cvdh-a181r，其氨基酸序列如seq id no: 4所示，该突变体可以高效催化底物柠檬醛生成( r)-香茅醛。
4、本专利技术提供的上述突变体可人工合成，也可通过先合成其编码基因，再进行生物表达得到，如使用重组技术从原核生物（例如大肠杆菌）或真核生物（例如酵母、高等植物）中表达获得。
5、在一些实施方案中，上述烯还原酶突变体是通过将含有其编码基因的重组表达载体转化进入大肠杆菌（例如 e.colibl21 (de3) ）构建重组基因工程菌，然后培养该菌株，并添加诱导剂诱导表达得到。
6、在第二方面，本专利技术提供一种编码上述烯还原酶突变体的核酸分子。
7、在一些实施方案中，编码上述烯还原酶突变体的核酸分子如seq id no: 3所示。
8、本专利技术提供的上述核酸分子通常可以通过使用pcr仪扩增或人工合成的方法获得。
9、在第三方面，本专利技术提供一种重组载体，其包含上述任一所述的核酸分子；
10、所述重组载体包括克隆载体和表达载体，所述克隆载体用于复制相关基因，所述表达载体用于表达相关基因。
11、在一些实施方案中，上述重组载体为重组表达载体pet-26b(+)- cvdh-a181r。
12、在第四方面，本专利技术提供一种重组细胞，其包含上述任一所述的核酸分子和/或重组载体。
13、在一些实施方案中，所述重组细胞经诱导后表达上述烯还原酶突变体。
14、在一些实施方案中，所述重组细胞的构建方法包括：
15、将所述重组载体转化到表达宿主细胞中，经培养并添加诱导剂诱导表达，得到上述烯还原酶突变体。
16、进一步地，所述重组载体为上述任一所述的重组载体，所述表达宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，能满足重组载体可稳定地自行复制，并且其所携带基因可被有效表达即可，可以为原核生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等，优选大肠杆菌表达宿主 e.colibl21 (de3）。
17、在一些实施方案中，所述重组细胞为 e.colibl21(de3)/ pet-26b(+)- cvdh-a181r，是将重组表达载体pet-26b(+)- cvdh-a181r转化至大肠杆菌 e.colibl21(de3)中获得的重组基因工程菌。重组基因工程菌表达烯还原酶突变体时所使用的培养基可以是本领域可以使重组基因工程菌生长并表达本专利技术的烯还原酶突变体的培养基，例如lb培养基。
18、培养方法和培养条件没有特殊要求，保证重组基因工程菌株正常生长即可，并在适当温度条件下诱导表达烯还原酶突变体。优选的培养方法为：将重组菌 e.colibl21(de3)/ pet-26b(+)- cvdh-a181r接种至装有含卡那霉素的lb液体培养基的试管中，37°c、220 rpm培养12 小时，按1-2%(v/v)的接种量转接至装有100 ml 含卡那霉素的lb液体培养基的500 ml摇瓶中，置于37°c、220 rpm培养，当培养液的od600达到0.6-0.8时，加入终浓度为100-500 μm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)作为诱导剂，16°c条件下诱导16-24小时后，将培养液离心，收集菌体沉淀，使用生理盐水洗涤，获得重组细胞。
19、在第五方面，本专利技术提供一种制备烯还原本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种烯还原酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。
2.编码权利要求1所述的烯还原酶突变体的核酸分子。
3.一种重组载体，其包含权利要求2所述的核酸分子。
4.一种重组细胞，其包含权利要求2所述的核酸分子和/或权利要求3所述的重组载体。
5.一种制备烯还原酶的方法：包括：
6.权利要求1所述的烯还原酶突变体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的重组载体和/或权利要求4所述的重组细胞在制备(R)-香茅醛中的应用。
7.一种制备(R)-香茅醛的方法，包括：以权利要求1所述的烯还原酶突变体、权利要求4所述的重组细胞和/或权利要求5所述方法制备得到的烯还原酶作为催化剂，催化柠檬醛进行还原反应，得到(R)-香茅醛。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述还原反应的底物为(E/Z)-柠檬醛、(E)-柠檬醛或(Z)-柠檬醛。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述还原反应的体系pH为5-9。
10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于：所
...【技术特征摘要】
1.一种烯还原酶突变体，其氨基酸序列如seq id no: 4所示。
2.编码权利要求1所述的烯还原酶突变体的核酸分子。
3.一种重组载体，其包含权利要求2所述的核酸分子。
4.一种重组细胞，其包含权利要求2所述的核酸分子和/或权利要求3所述的重组载体。
5.一种制备烯还原酶的方法：包括：
6.权利要求1所述的烯还原酶突变体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的重组载体和/或权利要求4所述的重组细胞在制备(r)-香茅醛中的应用。
7...
【专利技术属性】
技术研发人员：张光祥，姜君鹏，赵伟，张雅萍，张永振，黎源，
申请(专利权)人：万华化学集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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