一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备方法技术

一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备方法，其制备步骤如下：①生产用毒种的制备；②制苗用病毒液的制备；③灭活疫苗制备：将病毒含量≥１０↑［７．０］ＴＣＩＤ↓［５０］／ｍｌ病毒液在４℃灭活４８小时后，取灭活病毒液９４～９８份（体积份），加入２～６份（体积份）的吐温－８０混合制成水相；取注射用白油９４份（体积份），司本－８０６（体积份）份混合后制成油相；将水相与油相混合之比为１∶１．５～１∶２．５一起乳化即制成，分装，入库。该方法具有生产工艺简单，制出的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗效果好等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属兽医生物新医药
，具体地讲涉及一种猪繁殖与呼吸综合 征灭活疫苗的制备方法。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的繁 殖障碍性和呼吸道的传染病，在世界范围内广泛分布，造成了巨大的经济损失， 严重制约了养猪业的健康发展，已经成为猪病研究的热点。现在由于对猪繁殖 与呼吸综合征尚无有效治疗方法，注射疫苗是防制该病的重要手段。目前国内 外已研制出许多疫苗来预防和控制猪繁殖与呼吸综合征，但由于使用猪繁殖与 呼吸综合征弱毒疫苗预防猪繁殖与呼吸综合征有潜在的生物安全危险，因而兽 医科技工作者和生产人员多主张采用灭活苗预防。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的是公开一种猪繁殖与呼吸综合征 灭活疫苗的制备方法，该灭活疫苗可以有效地防止猪繁殖与呼吸综合征，并且 具有生产方便，使用安全，易于保存的优点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案所述，其制备步骤如下① 、生产用毒种的制备将已长成单层的Marc-145细胞倒去生长液，以含 0. 01TCIDs。/个细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株病毒液，37'C吸附1小时 后，加入含2y。新生牛血清的DMEM维持液，在37'C含5XC02培养箱中培养观察 48小时，冻融1次收获感染细胞毒液，装于灭菌容器内。② 、制苗用病毒液的制备将生长良好的单层Marc-145细胞，倒去生长液，按照0. 01TCIDs。/细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株生产用毒种，37'C吸附 1小时后，加入含2%新生牛血清的DMEM维持液，置37。C旋转培养至48小时收 获病毒液。③、灭活疫苗制备将病毒含量^107』TCID5。/ml病毒液在4。C灭活48小时 后，取灭活病毒液94 98份(体积份)，加入2 6份(体积份)的吐温-80混合制 成水相；取注射用白油94份(体积份)，司本-80 6(体积份)份混合后，随加随 搅拌至透明为止，加热到121'C、压力103kPa灭菌后备用，即为油相；将水相 与油相混合，混合之比为1:1.5 1:2.5—起乳化，分装，入库。所述猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株是本公司自行在国内分离的猪繁殖与呼 吸综合征病毒流行株CQ株，为国内流行的美洲型基因型毒株，与国内同期其它 分离株的同源性都在95%以上，该毒株繁殖特性好。在Marcl45细胞上的毒价 可达108()/ml以上。猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株的取得通过对从河南省猪繁殖与呼吸综 合征流行猪场送检的高热病流产死胎肺脏分离的病毒株进行细胞培养特性 观察、病毒理化特性测定、病毒核酸类型测定、病毒中和试验、RT-PCR鉴 定和动物回归等试验，证实分离的病毒株均为为猪繁殖与呼吸综合征病毒。 试验分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒株能被美洲型抗血清所中和。另外， 本研究应用美洲型PRRSV特异的引物进行的RT-PCR反应，能对本分离株扩 增出特异性DNA片段，对欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒则不能，进一步 证实分离毒为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒。将其命名为猪繁殖与呼吸 综合征病毒CQ株。所述制苗用病毒液创新采用低温灭活，2 8'C经48小时,可彻底灭活病毒， 并不影响其免疫原性。该猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗采用的油相的配方与常规不同，白油94份, 司本-80 6份，无硬铝。实验证明没有硬脂酸铝的油苗粘度更小，稳定性也好， 对动物机体的刺激性也小。由于采用了如上所述的技术方案，本专利技术具有如下积极效果① 、采用的毒株为在国内分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株，免疫原 性良好，用其制备的疫苗免疫国内猪群能更好的抵抗野毒的攻击，为猪繁殖与 呼吸综合征疫情的防控提供了技术保障。② 、采用了转瓶生产的方法，而且采用先进科学的接毒工艺，不仅提高了 产量，而且所收获的病毒液毒价也高。猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株在 Marc-145细胞上增殖过程中，接种剂量为0.01 0.1TCID5(/个细胞，最佳收毒时 间为48 60h,最佳基础培养基为DMEM，冻融次数以一次为宜，这大大的降低 了生产成本，简化了生产工艺。③ 、本专利技术采用低温灭活，4'C经48小时，可彻底灭活病毒，并不影响其免 疫原性。 、使用的佐剂属于免疫增强剂中的一类，单独使用时一般没有免疫原性， 与抗原物质合并使用时，能增强抗原物质的免疫原性，增强机体的免疫应答， 或者改变机体免疫应答类型。本专利技术采用的佐剂是白油、吐温-80、司盘，没有 加入硬脂酸铝稳定剂，实验证明没有硬脂酸铝的油苗粘度更小，稳定性也好， 对动物机体的刺激性也小。本专利技术成品检验效力检验部分采用血清学的方法评 价，比常规的攻毒检测方法更为准确、直观、快速、结果更可靠，而且更符合生 物安全的原则。 具体实施例方式实施例1: ，其制备步骤如下① 、生产用毒种的制备将已长成单层的Marc-145细胞倒去生长液，以含 0. 01TCID5。/个细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株病毒液，37'C吸附1小时 后，加入含2y。新生牛血清的DMEM维持液，在37C含5XC02培养箱中培养观察 48小时，冻融1次收获感染细胞毒液，装于灭菌容器内。② 、制苗用病毒液的制备将生长良好的单层Marc-145细胞，倒去生长液， 按照0. 01TCID5。/细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株生产用毒种，37'C吸附 l小时后，加入含2M新生牛血清的DMEM维持液，置37。C旋转培养至48小时收 获病毒液。③、灭活疫苗制备将病毒含量》l()7。TCID5。/ml病毒液在4。C灭活48小时 后，取灭活病毒液94份(体积份)，加入6份(体积份)的吐温-80混合制成水相； 取注射用白油94份(体积份)，司本-80 6(体积份)份混合后，随加随搅拌至透 明为止，加热到12rC、压力103kPa灭菌后备用，即为油相；将水相与油混合， 混合之比为1:1.5—起乳化，分装，入库。实施例2: —种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备方法，其制备步骤如下① 、生产用毒种的制备将已长成单层的Marc-145细胞倒去生长液，以含 0. 01TCID5。/个细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株病毒液，37'C吸附1小时 后，加入含2y。新生牛血清的DMEM维持液，在37。C含5XC02培养箱中培养观察 48小时，冻融1次收获感染细胞毒液，装于灭菌容器内。② 、制苗用病毒液的制备将生长良好的单层Marc-145细胞，倒去生长液， 按照0. 01TCIDs。/细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株生产用毒种，37。C吸附 1小时后，加入含2%新生牛血清的DMEM维持液，置37。C旋转培养至48小时收 获病毒液。③、灭活疫苗制备将病毒含量》l(TTCID5。/ml病毒液在4'C灭活48小时后，取灭活病毒液96份(体积份)，加入4份(体积份)的吐温-80混合制成水相； 取注射用白油94份(体积份)，司本-80 6(体积份)份混合后，随加随搅拌至透 明为止，加热到12rC、压力103kPa灭菌后备用，即为油相；将水相与油相混 合，混合之比为1:2.0—起乳化，分装，入库。实施例3: —种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备方法，其制备步骤如下① 、生产用毒种的制备将已长成单层的Marc-145细胞倒去生长本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备方法，其特征是：其制备步骤如下：　①、生产用毒种的制备：将已长成单层的Ｍａｒｃ－１４５细胞倒去生长液，以含０．０１ＴＣＩＤ↓［５０］／个细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒ＣＱ株病毒液，３７℃吸附１小时后 ，加入含２％新生牛血清的ＤＭＥＭ维持液，在３７℃含５％ＣＯ２培养箱中培养观察４８小时，冻融１次收获感染细胞毒液，装于灭菌容器内；　②、制苗用病毒液的制备：将生长良好的单层Ｍａｒｃ－１４５细胞，倒去生长液，按照０．０１ＴＣＩＤ５０／细胞 接种猪繁殖与呼吸综合征病毒ＣＱ株生产用毒种，３７℃吸附１小时后，加入含２％新生牛血清的ＤＭＥＭ维持液，置３７℃旋转培养至４８小时收获病毒液；　③、灭活疫苗制备：将病毒含量≥１０↑［７．０］ＴＣＩＤ↓［５０］／ｍｌ病毒液在４℃灭活４８小 时后，取灭活病毒液９４～９８份（体积份），加入２～６份（体积份）的吐温－８０混合制成水相；取注射用白油９４份（体积份），司本－８０　６（体积份）份混合后，加热到１２１℃、压力１０３ｋＰａ灭菌后备用，即为油相；将水相与油相混合，混合之比为１ ∶１．５～１∶２．５，一起乳化，分装，入库。...

【技术特征摘要】
1、一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备方法，其特征是其制备步骤如下①、生产用毒种的制备将已长成单层的Marc-145细胞倒去生长液，以含0.01TCID50/个细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株病毒液，37℃吸附1小时后，加入含2％新生牛血清的DMEM维持液，在37℃含5％CO2培养箱中培养观察48小时，冻融1次收获感染细胞毒液，装于灭菌容器内；②、制苗用病毒液的制备将生长良好的单层Marc-145细胞，倒去生长液，按照0.01TCID50/细胞接种猪繁殖与呼吸综合征...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙进忠，乔荣岑，习向锋，荣骏弓，闵亚杰，孟照国，杨海岳，晋春霞，
申请(专利权)人：洛阳普莱柯生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]