【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物农药或微生物领域，特别是涉及一种特异性检测枯草芽孢杆菌的试剂盒及其在荧光定量pcr检测枯草芽孢杆菌中的应用。
技术介绍
1、
2、枯草芽孢杆菌是目前微生物农药中应用最为广泛的微生物物种，具有耐干燥、耐热和耐紫外线辐射等有优点，生防效果优异的芽孢杆菌广泛应用于农作物病害的防治中。枯草芽孢杆菌属芽孢杆菌属，该类群物种形态学及生物学特征相似，较难利用形态和生理生化特征区分。且该类群物种间在常用鉴别基因相似度较高，导致分子鉴定精确度较低。基于以上社会需求及目前存在的技术难点，
3、现有枯草芽孢杆菌分子检测技术中，主要应用常规pcr，对样本中微生物dna提取后，利用特异性引物进行pcr，pcr产物还需要进行琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像仪下观察特异性条带，该方法检测周期长，费时费力。
4、已报道的枯草芽孢杆菌荧光检测技术应用的方法为探针法荧光定量pcr技术，pcr扩增时在加入一对引物的同时还需加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。该方法需要加入探针引物，引物试剂用量较大。
5、目前公开的枯草芽孢杆菌检测体系主要为显微镜计数、常规pcr、taqman探针法存在误差大、效率低、周期长、检测试剂用量大等问题。
技术实现思路
1、基于技术背景中存在的技术问题，本专利技术结合现代分子生物学手段，基于sybrgreen染料法荧光pcr技术，建立了一种快速、精准、经济的特异性检测枯草芽孢杆菌的试剂盒及
2、为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：
3、一种特异性检测枯草芽孢杆菌的试剂盒，含特异性引物bsspf/bsspr；bsspf：tgaaattggcaggcgctcta，
4、bsspr：gcaggcgtaccgtcttgata。
5、所述试剂盒为2×chamq universal sybr qpcr master mix 10μl，dna工作液1μl，bsspf(10μm)0.4μl，bsspr(10μm)0.4μl，ddh2o 8.2μl。
6、一种所述的特异所述性检测枯草芽孢杆菌的试剂盒的应用，所述试剂盒在特异所述性检测枯草芽孢杆菌中的应用。
7、一种特异性检测枯草芽孢杆菌的荧光定量pcr检测方法，利用所述试剂盒进行荧光定量pcr检测，根据ct值和扩增曲线判定检测。
8、检测组ct值≤40，且出现指数型扩增曲线；对照组ct值>40，且未出现指数型扩增曲线，判定检测组为阳性。
9、具体为：
10、a、利用ctab法对检测组待检测样本中微生物dna进行提取；
11、b、利用权利要求1所述试剂盒进行荧光pcr检测；
12、c、反应程序为95℃预变性1min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，重复变性、退火和延伸至40个循环；
13、d、根据ct值和扩增曲线判定。结果判定标准为检测组ct值≤40，且出现指数型扩增曲线；对照组ct值>40，且未出现指数型扩增曲线，判定检测组为阳性。
14、所述荧光pcr检测可对不同枯草芽孢杆菌制剂产品进行检测，且检测样品dna工作液最低检测浓度为10fg/ml。
15、本专利技术所具有的优点：
16、本专利技术基于sybr green染料法荧光pcr技术的枯草芽孢杆菌检测体系，以ligb基因设计特异性引物，通过优化反应程序，建立枯草芽孢杆菌sybr green染料法荧光pcr检测技术，以该引物为基础的枯草芽孢杆菌荧光检测体系灵敏度高于目前所报道的所有检测体系，最低检出限为10fg/μl的枯草芽孢杆菌dna浓度。该技术具有检测周期短、试剂节约、误差小等优点，为枯草芽孢杆菌产品的开发与应用提供了质量评估与检测技术，进一步为微生物农药检测提供有效的技术，具有良好的应用价值。
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1.一种特异性检测枯草芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于：含特异性引物BsspF/BsspR；
2.按权利要求1所述的特异所述性检测枯草芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μl，DNA工作液1μl，BsspF(10μM)0.4μl，BsspR(10μM)0.4μl，ddH2O 8.2μl。
3.一种权利要求1所述的特异所述性检测枯草芽孢杆菌的试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒在特异所述性检测枯草芽孢杆菌中的应用。
4.一种特异性检测枯草芽孢杆菌的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述试剂盒进行荧光定量PCR检测，根据CT值和扩增曲线判定检测。
5.按权利要求4所述的特异性检测枯草芽孢杆菌的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，检测组Ct值≤40，且出现指数型扩增曲线；对照组Ct值>40，且未出现指数型扩增曲线，判定检测组为阳性。
6.按权利要求5所述的特异性检测枯草芽孢杆菌的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，
...【技术特征摘要】
1.一种特异性检测枯草芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于：含特异性引物bsspf/bsspr；
2.按权利要求1所述的特异所述性检测枯草芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为2×chamq universal sybr qpcr master mix 10μl，dna工作液1μl，bsspf(10μm)0.4μl，bsspr(10μm)0.4μl，ddh2o 8.2μl。
3.一种权利要求1所述的特异所述性检测枯草芽孢杆菌的试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒在特异所述性检测枯草芽孢杆菌中的应用。
4.一种特异性检测枯草芽孢杆菌的荧光定量pcr检测方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：于海博，杨闻翰，梅宝贵，王婉秋，张嘉月，张丹，郭丹，李乐瑶，魏钗，
申请(专利权)人：沈阳沈化院测试技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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