【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞生物学及微流控，具体涉及一种细胞趋电迁移监测微流控芯片、其制备方法及监测方法。
技术介绍
1、目前，恶性肿瘤作为重要的全球性公共卫生问题，严重威胁着人类生命健康和生活质量，尽管诊断和治疗手段不断提高，但侵袭性强、转移率高仍然是导致肿瘤治疗失败和患者死亡的主要原因。在恶性肿瘤的发展过程中，脱落的肿瘤细胞可以侵入血液和淋巴液，进而向远端迁移至新的组织位点形成转移瘤。研究显示肿瘤的发展及转移依赖于肿瘤细胞所处的复杂微环境(主要包括临近的非肿瘤细胞、生长因子、趋化因子和细胞外基质)，如同“种子与土壤”共为一体，肿瘤细胞与其所在的微环境互为依存又相互制约。
2、传统方法研究细胞迁移主要基于划痕实验、boyden小室和transwell小室等，对肿瘤微环境因素的考虑较单一，且获取数据结果往往是来自大量细胞的群体响应，容易忽略少量细胞的特异性表现。随着微纳米加工技术的发展成熟，微流控芯片以其网格式的微小通道设计、多种单元操作技术的灵活组合等优势，可同时在时间和空间上对微流体进行精确控制等特点，在肿瘤微环境模拟和细胞迁移研究方面展现出独特的应用前景。
3、电生理学家检测到内源性直流电场(dcef)(几—几百mv/mm)广泛存在于多种肿瘤组织周围，这种电场来自于肿瘤细胞表面电荷改变产生的跨上皮电位(tep)。研究发现该电场能够增强肿瘤细胞的活动能力，并诱导细胞表现出沿一定方向迁移的趋势，且高转移潜能的肿瘤细胞趋电迁移能力显著高于低转移潜能的肿瘤细胞。近年来借助微流控芯片的优势，一些直流电场模拟装置被设计开
4、肿瘤细胞的(趋电)迁移不仅与肿瘤细胞的异质性有关，还受到微环境中非肿瘤细胞(基质细胞)的影响，如内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等。在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞分泌因子释放到肿瘤微环境中，与局部或者远处的基质细胞之间通过旁分泌作用发生交互作用，为肿瘤细胞的生长和定向转移营造适宜的微环境。同时，基质细胞可产生趋化因子、生长因子和基质降解酶，促进血管生成、参与细胞外基质(ecm)重塑、免疫逃逸以及肿瘤细胞上皮-间质转化等有利于肿瘤发生发展的途径，对肿瘤侵袭和转移具有重要的促进作用。基于此，在研究肿瘤细胞的趋电迁移时，基质细胞的影响同样不可忽视，深入探讨基质细胞与肿瘤细胞在电场微环境中的作用，对于阐明细胞微环境在肿瘤进展和/或转移过程中发挥的作用具有重要意义。然而，目前肿瘤细胞趋电迁移模型主要集中于肿瘤细胞自身，无法同时监测多细胞联合培养条件下肿瘤细胞的趋电迁移。
5、现有技术中，还没有同时结合肿瘤周围的基质细胞微环境研究肿瘤细胞趋电迁移的相关报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种细胞趋电迁移监测微流控芯片、其制备方法及监测方法，用于模拟体内复杂环境下肿瘤细胞趋电迁移研究。
2、本专利技术的目的是这样实现的：
3、一种细胞趋电迁移监测微流控芯片，该微流控芯片内设有若干平行的电场通道以及与电场通道交叉连通的两条流体通道以及两条狭窄通道；两条狭窄通道位于两条流体通道之间，且两条狭窄通道分别与两条流体通道相对设置；两条狭窄通道之间呈8～15°的夹角，狭窄通道用于对悬浮细胞进行截留；两条狭窄通道之间的电场通道为共培养区域，在电场作用下，由两条流体通道进入的不同细胞可贴壁自两条狭窄通道进入共培养区域。
4、优选的，电场通道的两端分别连接有缓冲池，缓冲池的上方开有电场刺激孔。
5、优选的，在流体通道的两端分别设有进样孔和出样孔。
6、优选的，流体通道和电场通道的高度相同，均为35～40μm；狭窄通道的高度设置为8～10μm。
7、优选的，两条狭窄通道之间呈10°的夹角。
8、优选的，不同电场通道上的共培养区域的长度不同，共培养区域的长度范围为380～1630μm。
9、本专利技术还提供了一种细胞趋电迁移监测微流控芯片的制备方法，该微流控芯片是由上下两层pdms通道结构对齐后经氧等离子体键合而成，具体制备方法如下：
10、s1、使用激光打印上下两层pdms通道结构图案，得到掩膜；
11、s2、将掩膜置于印制电路板上，紫外曝光显影后，将印制电路板置于fecl3溶液中蚀刻，蚀刻结束后，流水冲洗晾干，制得上下两层芯片模板；
12、s3、将pdms预聚物和交联剂混合搅拌均匀，浇灌于印制电路板上，除气泡后置于烘箱中烘烤固化；
13、s4、待pdms固化冷却后将其从模板上剥落，在上层pdms通道结构的对应位置打孔；
14、s5、采用氧等离子体对上下两层pdms通道结构进行表面改性，之后在显微镜下使上下两层通道对齐并粘合，制得微流控芯片。
15、优选的，步骤s4中，所打孔包括电场刺激孔、进样孔和出样孔。
16、本专利技术还提供了一种细胞趋电迁移监测方法，该细胞趋电迁移监测方法采用了上述细胞趋电迁移监测微流控芯片，具体方法如下：
17、(1)对两种不同细胞进行培养；
18、(2)将微流控芯片经灭菌及表面处理后，置于培养皿中备用：首先用酒精浸泡芯片通道和缓冲池，同时紫外照射进行灭菌处理；然后用pbs缓冲溶液冲洗通道和缓冲池，去除酒精残留，将20μg/ml的纤连蛋白注入芯片内，37℃孵育2h以增强细胞的贴壁能力；
19、(3)接种细胞：首先吸弃纤连蛋白，然后将步骤(1)培养的一种细胞悬液注入其中一个流体通道中，同时在同侧电场刺激孔处加入完全培养液，使细胞平行流经各电场通道，且悬浮细胞被截留在靠近共培养区域一侧的狭窄通道处；
20、(4)将芯片周围加无菌水保湿，置于37℃、5％co2培养箱中孵育，待步骤(3)中细胞贴壁后，在另一流体通道中接种步骤(1)培养的另一种细胞；
21、(5)待两种细胞全部贴壁后，将铂丝电极通过盐桥分别插入两个电场刺激孔，外加电压，在电场通道中形成直流电场，在电场刺激下，两种细胞可贴壁进入共培养区域。
22、优选的，步骤(4)中，接种另一细胞前可使用cell tracker荧光探针进行标记。
23、本专利技术具有如下有益效果：
24、本专利技术在模拟肿瘤周围直流电场的同时，考虑了不同距离基质细胞对肿瘤细胞影响的微环境因素，构建了一种基于多细胞共培养环境的肿瘤细胞趋电迁移监测微流控芯片。采用该芯片在电场作用下监测肿瘤细胞趋电迁移，具有操作简单，样品用量少，电场形成稳定，整体尺寸较小等特点，可实现肿瘤电场微环境下细胞迁移及不同间距下细胞相互作用的长时间监测，进而对多细胞参与的肿瘤细胞趋电迁移进行全面考量，在肿瘤细胞生物学相关领域中具有良好的应用前景。
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1.一种细胞趋电迁移监测微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片内设有若干平行的电场通道以及与电场通道交叉连通的两条流体通道以及两条狭窄通道；两条狭窄通道位于两条流体通道之间，且两条狭窄通道分别与两条流体通道相对设置；两条狭窄通道之间呈8-15°的夹角，狭窄通道用于对悬浮细胞进行截留；两条狭窄通道之间的电场通道为共培养区域，在电场作用下，由两条流体通道进入的不同细胞可贴壁自两条狭窄通道进入共培养区域。
2.根据权利要求1所述的细胞趋电迁移监测微流控芯片，其特征在于，电场通道的两端分别连接有缓冲池，缓冲池的上方开有电场刺激孔。
3.根据权利要求1所述的细胞趋电迁移监测微流控芯片，其特征在于，在流体通道的两端分别设有进样孔和出样孔。
4.根据权利要求1所述的细胞趋电迁移监测微流控芯片，其特征在于，流体通道和电场通道的高度相同，均为35～40μm；狭窄通道的高度设置为8～10μm。
5.根据权利要求1所述的细胞趋电迁移监测微流控芯片，其特征在于，两条狭窄通道之间呈10°的夹角。
6.根据权利要求1所述的细胞趋电迁移监测微流控芯片，
7.权利要求1所述细胞趋电迁移监测微流控芯片的制备方法，其特征在于，该微流控芯片是由上下两层PDMS通道结构对齐后经氧等离子体键合而成，具体制备方法如下：
8.根据权利要求7所述的细胞趋电迁移监测微流控芯片的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所打孔包括电场刺激孔、进样孔和出样孔。
9.一种细胞趋电迁移监测方法，其特征在于，采用权利要求2所述细胞趋电迁移监测微流控芯片，包括如下步骤：
10.根据权利要求9所述的细胞趋电迁移监测方法，其特征在于，步骤(4)中，接种另一细胞前可使用Cell Tracker荧光探针进行标记。
...【技术特征摘要】
1.一种细胞趋电迁移监测微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片内设有若干平行的电场通道以及与电场通道交叉连通的两条流体通道以及两条狭窄通道；两条狭窄通道位于两条流体通道之间，且两条狭窄通道分别与两条流体通道相对设置；两条狭窄通道之间呈8-15°的夹角，狭窄通道用于对悬浮细胞进行截留；两条狭窄通道之间的电场通道为共培养区域，在电场作用下，由两条流体通道进入的不同细胞可贴壁自两条狭窄通道进入共培养区域。
2.根据权利要求1所述的细胞趋电迁移监测微流控芯片，其特征在于，电场通道的两端分别连接有缓冲池，缓冲池的上方开有电场刺激孔。
3.根据权利要求1所述的细胞趋电迁移监测微流控芯片，其特征在于，在流体通道的两端分别设有进样孔和出样孔。
4.根据权利要求1所述的细胞趋电迁移监测微流控芯片，其特征在于，流体通道和电场通道的高度相同，均为35～40μm；狭窄通道的高度设置为8～10μm。
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