【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别涉及一种增强的切刻酶依赖扩增的方法及应用。
技术介绍
1、全基因组扩增技术(whole genome amplification，wga)是能够实现在没有序列倾向性的前提下对整个基因组扩增以提供大量可供分析样品的技术
2、1基于pcr技术的wga方法(pcr-based wga)
3、1.1引物延伸预扩增法
4、引物延伸预扩增法(primerextension preamplification，pep)在所有wga方法中是较早出现的一种，pep法是一种基于pcr技术发展而来的wga方法，主要原理是使用15个碱基长的随机引物(n15，理论上有415种组合)在37℃的低退火温度下进行较长时间的退火，然后缓慢升温至55℃进行长时间的引物延伸，如此反复多个循环。但由于pep法使用随机引物以及较为不严格的pcr循环参数，因此可能导致不均衡的扩增结果和随机突变。
5、1.2简并寡核苷酸引物pcr
6、简并寡核苷酸引物pcr法(degenerate oligonucleotide primed pcr，dop-pcr)也是一种基于pcr技术的全扩增方法，其原理是使用部分简并的引物进行pcr反应(引物中间部分含有6个随机碱基)，在最初的几个循环中使用较低的温度(25℃)进行退火以确保引物与模板的结合，并缓慢升温至引物延伸温度进行引物延伸，完成最初几个循环后，再使用较高的退火温度(55℃)进行多循环常规pcr反应，对dop-pcr结果影响较大的因素是聚合酶及引物浓
7、1.3连接介导pcr
8、连接介导pcr(ligation-mediated pcr，lm-pcr)指的是一类有接头连接过程参与的pcr反应。lm-pcr全扩增技术需要通过3个步骤来实现：(1)模板dna的片段化处理：可通过物理剪切或限制性内切酶处理使基因组dna断裂成若干适合pcr扩增的片段。使用物理剪切法对dna进行处理时因无法预测片段末端结构，因此需要对其进行平末端化处理以满足其与接头进行连接的条件；如使用限制性内切酶对模板进行剪切，因各片段末端组成已知，因此大多数情况下无需对片段进行处理；(2)模板片段与接头连接：根据酶切片段类型，设计可与之连接的接头，在dna连接酶的作用下与模板片段两端连接，接头中含有一段外源通用引物序列，用作下一步pcr反应中的引物；(3)全扩增pcr反应：连接成功的模板片段经引物延伸后两端形成了通用引物结合位点，因此可以外源引入的通用引物进行pcr反应，包括接头在内的模板片段可同时得到扩增。lm-pcr虽然灵敏度高，且在扩增pcr时可以使用通用引物，但是lm-pcr操作繁琐且在实验过程中容易丢失模板dna。
9、2恒温全基因组扩增反应
10、2.1mda：多重置换扩增反应
11、多重置换扩增法(multiple displacement amplification，mda)是基于恒温核酸扩增技术的一种方法，相对pcr类全扩增方法出现较晚，其基本原理是使用一条硫代修饰的六核苷酸随机引物(n6)在恒温条件下与基因组随机退火，并在具有强链置换活性的phi29dna聚合酶的作用下发生链置换扩增反应，置换产生的单链序列又可与随机引物任意退火延伸，形成超分支扩增结构，由于phi29 dna聚合酶具有较强的持续合成dna的能力，因此可持续合成长达50～100kb的产物。由于mda法是一种恒温核酸扩增方法，可能存在一定的非特异性扩增问题，即体系内不含有模板时也会产生大量产物。mda法是目前公认应用最广泛的wga方法，操作简单且对实验仪器的要求极低，且使用非预变性的模板时也可取得良好的wga效果，可进一步简化实验操作及避免污染的产生，可广泛应用于基因组测序、cgh(高通量阵列比较基因组杂交技术)、snps(单核苷酸多态性)分析等相关领域，目前针对该方法开发的产品较为成熟，具有代表性的为qiagen公司的repli-g系列全扩增试剂盒。
12、2.2pwga：基于引物酶的全基因组扩增
13、基于引物酶的全基因组扩增(primer-based whole genome amplification，pwga)是一种由t7细菌噬菌体核酸复制方式演化而来的恒温全基因组扩增方法，相对于其他所有wga方法，pwga最大的特点是在扩增过程中不需要使用任何引物，且不需要对模板进行预变性处理。pwga过程中所需的t7 gp4蛋白可同时发挥解旋酶和引物酶的作用，该蛋白的c端部分可利用脱氧胸苷三磷酸(dttp)水解产生的能量来将dna双链解旋；而n端则行使引物酶(primase)的作用，其特异性识别3'-ctgg(g/t)-5'和3'-ctgtg-5'并产生短的rna作为扩增引物。引物生成后在t7 dna聚合酶全酶的作用下进行持续的扩增反应，由t7 gp2.5基因编码的单链dna结合蛋白(single-stranded dnabinding protein)与解旋产生的单链dna结合并与解旋酶/引物酶、聚合酶一起完成整个全基因组扩增过程，该扩增模式与滚环扩增(rolling circle amplification，rca)相似并可以产生长达40kb的产物。
14、3malbac：多次退火环状循环扩增技术
15、多次退火环状循环扩增技术(multiple annealing and looping-basedamplification cycles，malbac)结合了mda法与pcr方法的特点，使用的35nt长的引物，由一段固定的27nt通用引物序列和8nt随机碱基序列(n8)组成，在0℃时该8nt随机碱基序列可与模板任意退火，梯度升温至65℃后在具有链置换活性的bst dna聚合酶大片段作用下发生链置换聚合反应，得到一系列长度不一的(0.5～1.5kb)半扩增子(semi-amplicons)，在94℃变性、0℃退火以及65℃延伸循环后，上一循环中半扩增子形成了两端具有互补结构(27nt)的全扩增子(amplicons)，随后降低温度至58℃，使得到的扩增子两端互补形成loop结构，从而可以避免引物与其进行结合导致全扩增子倍增导致的不均衡扩增，因此可以很大程度上保证该循环发生的是线性扩增。在经过5个上述类似线性扩增循环后可得到大量全扩增子，并做为接下来pcr反应的模板，使用该27nt通用引物进行指数pcr反应，因此只有全扩增子才能得到有效扩增，从而实现对整个基因组的高效而又均衡的全扩增。
16、4转座子插入线性扩增(linear amplification via transposon insertion，lianti)
17、谢晓亮教授在science上的报告了一种改进的单细胞的wga法：通过转座子插入进行线性放大本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.同源重组酶在提高全基因组预扩增效率中的应用；
2.组合物，其特征在于，包括切刻酶和同源重组酶，且不包括引物。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述切刻酶包括Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.AlwI和/或Nt.CviPII。
4.如权利要求2或3所述的组合物，其特征在于，所述同源重组酶包括Tth_RecA。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述Tth_RecA具有：
6.如权利要求2至5所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括单链结合蛋白和/或DNA聚合酶。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述单链结合蛋白包括Tth_SSB。
8.如权利要求6或7所述的组合物，其特征在于，所述单链结合蛋白具有：
9.如权利要求6至8任一项所述的组合物，其特征在于，所述DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性以及链置换活性，且不具有5’-3’外切酶活性。
10.如权利要求6至9任一项所述的组合物，其特征在于，所述DNA聚合酶包括Bst DNA聚合酶。
11.如权利要求2至10任一项所述的组合物在核酸扩增中的应用；
12.如权利要求2至10任一项所述的组合物在制备核酸扩增试剂、试剂盒和/或装置中的应用，所述核酸扩增包括全基因组扩增。
13.试剂、试剂盒和/或装置，其特征在于，包括如权利要求2至10任一项所述的组合物，以及可接受的辅料、助剂和/或部件。
14.全基因组的预扩增方法，其特征在于，基于如权利要求2至10任一项所述的组合物扩增。
15.全基因组的预扩增方法，其特征在于，包括：将如权利要求2至10任一项所述的组合物、缓冲液、助剂和待扩增基因组核酸混合，反应，获得全基因组预扩增产物；
...【技术特征摘要】
1.同源重组酶在提高全基因组预扩增效率中的应用；
2.组合物，其特征在于，包括切刻酶和同源重组酶，且不包括引物。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述切刻酶包括nt.bbvci、nt.bstnbi、nt.alwi和/或nt.cvipii。
4.如权利要求2或3所述的组合物，其特征在于，所述同源重组酶包括tth_reca。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述tth_reca具有：
6.如权利要求2至5所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括单链结合蛋白和/或dna聚合酶。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述单链结合蛋白包括tth_ssb。
8.如权利要求6或7所述的组合物，其特征在于，所述单链结合蛋白具有：
9.如权利要求6至8任一项所述的组合物，其特征在于，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴强，王志峰，伏东科，李基，毕万里，
申请(专利权)人：苏州新海生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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