【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别涉及氨基替换酶突变体、复合酶、固定化酶及麦角硫因的制备方法。
技术介绍
1、麦角硫因是一种天然存在的、稀有的氨基酸，结构上它属于组氨酸的硫脲衍生物，其咪唑环上含有一个硫原子。自然界中相对较少的生物如放线菌、“蓝细菌”和某些真菌能生物合成麦角硫因。麦角硫因于1909年被发现，并名称也是以其首次提纯的麦角菌命名，而其化学结构在1911年确定。尽管麦角硫因在人体内的作用还处于研究中，其具体的生理作用也不是很清楚，但是大量研究证实，人类通过饮食在红细胞、骨髓、肝脏、肾脏、精液和眼睛中积累麦角硫因。部分研究也初步表明麦角硫因具有清除自由基、维持细胞正常生长、细胞免疫、美白、抗衰老等独特的生理功能。2018年麦角硫因被列入欧盟新资源食品清单，现主要作为膳食补充剂出售。欧洲食品安全局饮食产品小组报告的婴儿每日安全限量为2.82毫克/千克体重，幼儿为3.39毫克/千克，成人(包括孕妇和哺乳期妇女)为1.31毫克/千克。由于其有效及安全性，麦角硫因在食品、化妆品、其它功能性食品以及生物医药等行业具有广阔的应用前景。迄今为止，麦角硫因的推广应用极大的受限于其高昂的价格，因此开发一种廉价、高效、易于规模化的麦角硫因生产工艺就显得尤为迫切。
2、现今市面上介绍的麦角硫因制备方法比较多，但基本上可分为化学合成法与生物发酵生产法。在化学合成工艺中有酯化的l-组氨酸为起始原料，通过官能团选择性保护后可以先对氨基进行三甲基化再进行氮杂环上的硫化(参考文献：专利us7767826b2，us20090093642a1)，抑或是先
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了氨基替换酶突变体、复合酶、固定化酶及麦角硫因的制备方法。本专利技术提供了氨基替换酶突变体，该酶能利用三甲胺将组氨酸的氨基替换下来从而生成三甲基组氨酸(hercynine)；再结合自养黄色杆菌(xanthobacterautotrophicus)的三甲基组氨酸氧化酶(heroxy，uniprotid：a7ip38)，该酶能将半胱氨酸的-sh转移到三甲基组氨酸氮杂环上；以及克雷伯氏菌(klenkiabrasiliensis)体内的裂解酶(hercylyase，uniprotid：a0a1g7ne74)最终裂解上步氧化酶产物得麦角硫因。
2、本专利技术运用麦角硫因体外酶法制备思路，跳出生物体内已知的合成路径，开创性的将一种新颖的氨基酸替换酶(hismuta),三甲基组氨酸氧化酶(heroxy)以及裂解酶(hercylyase)联合使用，一次性高收率的将组氨酸直接转化成麦角硫因。该方法具有催化底物浓度高，操作简便，产物纯度高等特点，因此适合于麦角硫因的规模化生产。
3、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
4、本专利技术提供了氨基替换酶突变体，其包括以下任意一个或多个位点突变：
5、l8i；和/或
6、q70v；和/或
7、d71k；和/或
8、a186l；和/或
9、s192t；和/或
10、l201v；和/或
11、v205c；和/或
12、s207m；和/或
13、n304i；和/或
14、m308s；和/或
15、d443h；和/或
16、e470m。
17、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述氨基替换酶突变体具有：
18、(i)、如seq id no:1所示的氨基酸序列；或
19、(ii)、在如(i)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
20、(iii)、与如(i)或(ii)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
21、本专利技术还提供了复合酶，其包括所述氨基替换酶突变体、三甲基组氨酸氧化酶和裂解酶。
22、在本专利技术的一些具体实施方案中，三甲基组氨酸氧化酶(heroxy)来源于自养黄色杆菌(xanthobacterautotrophicus，uniprotid：a7ip38)。
23、在本专利技术的一些具体实施方案中，裂解酶(hercylyase)来源于克雷伯氏菌(klenkiabrasiliensis)体内(uniprotid:a0a1g7ne74)。
24、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述氨基替换酶突变体n-端还包括蛋白配对单元riad；和/或
25、所述三甲基组氨酸氧化酶n端还包括蛋白配对单元ridd。
26、本专利技术还提供了固定化酶，包括如下任意项：
27、(i)、所述氨基替换酶突变体；或
28、(ii)、所述复合酶。
29、本专利技术还提供了编码所述氨基替换酶突变体，所述复合酶或所述固定化酶的核酸分子，编码所述氨基替换酶突变体的核酸分子具有：
30、(i)、如seq id no:6所示的核苷酸序列；或
31、(ii)、与(i)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(i)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
32、(iii)、与(i)或(ii)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(i)或(ii)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
33、(iv)、与(i)、(ii)或(iii)所述核苷酸序列具有序列同源性90％以上的核苷酸序列。
34、本专利技术还提供了重组载体，包括所述核酸及骨架载体。
35、本专利技术还提供了宿主，其包括所述重组载体。
36、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.氨基替换酶突变体，其特征在于，包括以下任意一个或多个位点突变：
2.复合酶，其特征在于，包括如权利要求1所述的氨基替换酶突变体、三甲基组氨酸氧化酶和裂解酶。
3.如权利要求2所述的复合酶，其特征在于，所述氨基替换酶突变体N-端还包括蛋白配对单元RIAD；和/或
4.固定化酶，其特征在于，包括如下任意项：
5.编码如权利要求1所述氨基替换酶突变体，如权利要求2或3所述复合酶或如权利要求4所述固定化酶的核酸分子，其特征在于，编码所述氨基替换酶突变体的核酸分子具有：
6.重组载体，其特征在于，包括如权利要求5所述核酸及骨架载体。
7.宿主，其特征在于，包括如权利要求6所述重组载体。
8.以下任意项在制备麦角硫因中的应用：
9.麦角硫因的制备方法，其特征在于，包括利用如下任意项制备麦角硫因：
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
【技术特征摘要】
1.氨基替换酶突变体，其特征在于，包括以下任意一个或多个位点突变：
2.复合酶，其特征在于，包括如权利要求1所述的氨基替换酶突变体、三甲基组氨酸氧化酶和裂解酶。
3.如权利要求2所述的复合酶，其特征在于，所述氨基替换酶突变体n-端还包括蛋白配对单元riad；和/或
4.固定化酶，其特征在于，包括如下任意项：
5.编码如权利要求1所述氨基替换酶突变体，如权利要求2或3所述复合酶或如权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵弘，邓雯婷，秦国富，何秀秀，于铁妹，潘俊锋，刘建，
申请(专利权)人：深圳瑞德林生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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