【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种基于内参基因检测载体拷贝数的引物和探针、方法及应用。
技术介绍
1、随着生物技术的发展，细胞免疫治疗在治疗血液肿瘤中展示了极高的有效性。用于细胞免疫治疗的病毒性载体，包括腺病毒、逆转录病毒和慢病毒载体。其中，腺病毒不能将外源基因整合到基因组中，且外源基因表达时间比较短；而逆转录病毒和慢病毒能够随机将外源基因整合到细胞的基因组中，实现外源基因的长久持续性表达。与逆转录病毒比较，慢病毒载体因为载体容量高、病毒滴度高、不受细胞分裂时期限制且无被基因沉默的风险，在临床上常常作为疾病的治疗工具。
2、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)nk细胞，是将能识别某种肿瘤抗原的抗体单链可变区(single chain antibody fragment，scfv)与胞内信号区在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染体外培养患者的nk细胞，使其表达嵌合抗原受体(car)。由于在转导过程中，慢病毒整合的半随机和不受控制性，会使整合后的宿主基因组产生突变，造成部分细胞具有癌变的可能；同时可变的拷贝数可以通过病毒载体转移并在nk细胞表面表达，这可能导致car-nk细胞群具有不同的细胞毒性能力。当外源基因以低拷贝数插入时能较好的表达，而多拷贝数插入的外源基因表达不稳定。因此，测定car-nk细胞基因组慢病毒载体的拷贝数，可以为car-nk细胞靶点基因的表达情况提供依据。
3、国内外相关研究中，普遍使用实时荧光定量聚合酶链式反应法(qpcr法)进行car拷贝
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种基于内参基因检测载体拷贝数的引物和探针、方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用所设计的引物和探针构建的检测方法，可使用qpcr法更精确的检测car-nk细胞中整合的病毒载体拷贝数。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种基于内参基因检测载体拷贝数的引物和探针，包括内参基因36b4的引物组和目的基因msln的引物探针组；
4、所述引物组的核苷酸序列如seq id no:1-2所示，所述引物探针组为如seq idno：3-4所示的引物对和seq id no：5所示的探针。
5、优选的是，所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。更优选的是，荧光基团选自vic、 fam、tet、hex、cy3和cy5中的一种；淬灭基团为fam。
6、本专利技术还提供一种基于内参基因检测载体拷贝数的方法，包括以下步骤：
7、以36b4为内参基因，利用上游引物36b4-f和下游引物36b4-r进行pcr扩增，再将扩增产物与t载体连接构建36b4质粒，并以所述36b4质粒为模板建立标准曲线i；所述36b4-f和所述36b4-r的核苷酸序列分别如seq id no：1和seq id no：2所示；
8、以msln为目的基因，利用特异性上游引物msln-f、特异性下游引物msln-r和探针msln-probe进行pcr扩增，将扩增产物与t载体连接构建msln质粒，并以所述msln质粒为模板建立标准曲线ii；所述msln-f、msln-r和msln-probe的核苷酸序列分别如seq id no：3、seq id no：4和seq id no：5所示；
9、利用所述36b4-f和所述36b4-r对待测样品中36b4基因进行实时荧光定量pcr检测，获得所述待测样品中36b4基因的ct值，通过所述标准曲线i计算所述待测样本的36b4基因拷贝数；利用所述msln-f、msln-r和msln-probe对待测样品中msln基因进行实时荧光定量pcr检测，获得所述待测样品中msln基因的ct值，通过所述标准曲线ii计算所述待测样本的msln基因拷贝数；
10、根据如下公式计算出每细胞中msln基因的拷贝数：
11、每细胞中目的基因的拷贝数（copies/cell）=目的基因的拷贝数/（内参基因的拷贝数/2）。
12、优选的是，所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。更优选的是，所述荧光基团选自vic、fam、tet、hex、cy3和cy5中的一种，所述淬灭基团为bhq1。
13、优选的是，所述36b4基因的实时荧光定量pcr检测反应体系为：36b4-f和36b4-r各1μl、dna模板5μl、2×tb green premix ex taq 10μl和无核酸酶水3μl；
14、反应程序为：95℃ 5min；95℃ 15s、60℃ 30s、72℃ 1min，40个循环；95℃ 10s，65℃ 1min，95℃ 1s。
15、优选的是，所述msln基因的实时荧光定量pcr检测反应体系为：msln-f和msln-r各1μl、msln-probe1μl、dna模板5μl、2×tb green premix ex taq 10μl和无核酸酶水2μl；
16、反应程序为：95℃ 5min；95℃ 10s、60℃ 45s、37℃ 30s，40个循环。
17、本专利技术还提供所述的引物和探针在检测car-nk细胞基因组载体的拷贝数中的应用。
18、优选的是，所述载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
19、本专利技术公开了以下技术效果：
20、本专利技术利用36b4基因引物组对待测样品进行pcr检测，获得待测样品中36b4基因的ct值，通过标准曲线i计算待测样本的36b4基因拷贝数；利用目的基因—msln基因引物探针组对待测样品进行pcr检测，获得待测样品中msln基因的ct值，通过标准曲线ii计算待测样本的msln基因拷贝数。根据每细胞中内参基因与目的基因间的关系可计算出每细胞中msln基因的拷贝数。
21、本专利技术以36b4为内源参照基因、msln即编码抗msln抗原的单链可变区的片段为目的基因，能够稳定且有效地检测出整合入car-nk细胞基因组中病毒载体拷贝数，且能够换算成每细胞中car-nk细胞基因组中整合的病毒载体拷贝数。本专利技术可以为car-nk细胞靶点基因的表达情况提供依据。
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1.一种基于内参基因检测载体拷贝数的引物和探针，其特征在于，包括内参基因36B4的引物组和目的基因MSLN的引物探针组；
2.如权利要求1所述的基于内参基因检测载体拷贝数的引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
3.一种基于内参基因检测载体拷贝数的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述36B4基因的实时荧光定量PCR检测反应体系为：36B4-F和36B4-R各1μL、DNA模板5μL、2×TB Green Premix Ex Taq 10μL和无核酸酶水3μL；
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述MSLN基因的实时荧光定量PCR检测反应体系为：MSLN-F和MSLN-R各1μL、MSLN-Probe1μL、DNA模板5μL、2×TB Green Premix Ex Taq10μL和无核酸酶水2μL；
7.如权利要求1或2所述的引物和探
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
...【技术特征摘要】
1.一种基于内参基因检测载体拷贝数的引物和探针，其特征在于，包括内参基因36b4的引物组和目的基因msln的引物探针组；
2.如权利要求1所述的基于内参基因检测载体拷贝数的引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
3.一种基于内参基因检测载体拷贝数的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述36b4基因的实时荧光定量pcr检测反应体系为：36b4-f和36b4-r...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘红，李蓓蓓，侯国栋，
申请(专利权)人：赛奥斯博生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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