皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途技术

本发明专利技术涉及一种皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途，构建方法包括：培养人皮肤成纤维细胞并构建含有ＣＴＬＡ４Ｉｇ－ＣＤ４０Ｉｇ双基因腺病毒载体；所述含有ＣＴＬＡ４Ｉｇ－ＣＤ４０Ｉｇ双基因腺病毒载体体外转染所述人皮肤成纤维细胞。低免疫原性皮肤组织工程种子细胞，由上述构建方法制成。用于转染人皮肤成纤维细胞的腺病毒载体，是含有与启动子有效连接的ＣＴＬＡ４Ｉｇ基因和ＣＤ４０Ｉｇ基因的Ａｄ５Ｆ３５嵌合型腺病毒载体。一种采用腺病毒载体在制备修复损伤皮肤的转染人皮肤成纤维细胞中的用途。本发明专利技术能有效降低种子细胞的免疫原性，且转染后的人皮肤成纤维细胞不影响其体外增殖性能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学
，特别是指皮肤损伤创面修复过程中应用 的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒栽体及用途。
技术介绍
皮肤是覆盖和保护体表的重要组织器官。由于各种原因造成的皮肤损伤 都需要进行及时的修复。对于这种缺损的修复常规多采用自体皮肤移植的方 法，但是这种方法不仅造成供皮区新的组织缺损，而且还经常受到供皮区来 源的限制。近年来利用组织工程技术制作组织工程皮肤已成为皮肤缺损移植治疗 的热点。组织工程皮肤一般是在体外将种子细胞接种到支架材料上，在体 外进行培养形成含有活细胞的皮肤样结构，然后用于临床使用。所用的种 子细胞可来源于自体，也可来源于异体。自体细胞由于需要在体外经过相 当长时间的培养扩增，容易延误治疗时间，因此目前组织工程皮肤的种子 细胞一般来源于异体包皮环切术或手术中废弃的皮肤分离出来的表皮细胞 和成纤维细胞。异体来源的种子细胞可以事先在体外进行大规模的扩增， 这样就缩短了患者等待自体细胞扩增的时间，为组织工程皮肤的商品化提供了重要的条件。但是异体来源的种子细胞也存在不足异体来源的种子细 胞始终存在免疫原性，移植到患者后不可避免的存在免疫排斥反应，严重影 响使用效果。皮肤移植的免疫排斥反应是典型的细胞性排斥反应，活化的T细胞在皮 肤移植排斥反应中起着决定性作用。而近几年的研究表明，T细胞必须在7TCR/MHC识别及辅助刺激信号的共同作用下才能完全活化，起到排斥作用；而 阻断辅助刺激信号，将会引起T细胞的无反应或细胞凋亡(apoptosis),抑制排斥作用的发生。迄今为止已发现多种辅助刺激信号系统，如 B7/CD28-CTLA4系统，CD40/CD40L系统，CD95 (Fas) /FasL系统等，而作为 皮肤组织工程的种子细胞-—人皮肤成纤维细胞中含有免疫抑制基因CTLA4Ig 和/或CD40Ig (包括利用病毒载体、非病毒载体、转基因等各种细胞修饰技术 实现人皮肤成纤维细胞含有CTLA4Ig和/或CD40Ig基因，或者实现人皮肤成 纤维细胞表达CTLA4Ig和/或CD40Ig蛋白)，因此如何通过CTLA4Ig和CD40Ig 基因的表达来阻断T细胞的活化信号通道，并抑制免疫排斥的发生是需要解 决的难题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种低免疫原性皮趺组织工程种子细胞及其构建方为实现上述目的，本专利技术提供了一种低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，包括培养人皮肤成纤维细胞并构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体； 所述含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒栽体体外转染所述人皮肤成纤维细胞。所述培养人皮肤成纤维细胞具体为将人皮肤成纤维细胞采用酶消化法 将组织消化散开，制备成单个细胞悬液，按5xl()3个/厘米2细胞密度接种于 培养瓶中，置于温度为37°C、含有体积百分比为5%(:02细胞培养箱中以含有 重量百分比为10%胎牛血清的DMEM细胞培养液进行培养，当细胞生长至80 %融合时进行传代、扩增。所述构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体具体为构建CTLA4Ig融合蛋白表达栽体；构建CD40Ig融合蛋白表达载体；构建CTLA4Ig和CD40Ig双基因克隆载体；构建pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体。所述构建CTLA4Ig融合蛋白表达载体具体为分离、活化人外周血单个核细胞；提取、鉴定所述人外周血单个核细胞的RNA;设计引物，第一引物包括CTLA-4基因胞外区N末端7个氨基酸残基和抑 瘤素M信号肽C端15个氨基酸残基，第二引物对应CTLA-4基因119-125位 氨基酸残基，并引入BclI酶切位点，第三引物包括抑瘤素M信号肽其余氨基 酸残基并与第一引物的抑瘤素M信号肽部分重叠，在第三引物的5，端引入Hindm酶切位点；反转录所述人外周血单个核细胞的RNA合成CTLA-4基因胞外区cDNA第 一链，以CTLA-4基因胞外区cDNA第一链为模板，采用第一引物和第二引物 进行第一轮扩增，以第一轮扩增的反应产物为模板，采用第二引物和第三引 物进行第二轮扩增，用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；构建pUC19-CTLA4融合质粒；用HindIII和Bcll双酶切所述pUC19-CTLA4融合质4立后，与经HindIII和 Bcll双酶切pX/Ig载体片段混合并连接，用连接后的产物再转化MC1061感受 态菌，得到含有质粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表达栽体，用HindIII和XbaI 酶切鉴定阳性转化克隆插入的片段长度；测定所述阳性转化克隆插入的片段的序列。所述构建CD40Ig融合蛋白表达载体具体为分离、活化人外周血单个核细胞；提取所述人外周血单个核细胞的RNA，并反转录为CD40基因胞外区cDNA; 用特异性引物扩增所述CD40基因胞外区cDNA，将扩增产物克隆到T载体上；所述特异性引物为第四引物5 ， -CGTCCTCGAGCCACCATGGTTCGTCTGCCTC-3 ， ，第五引物 5 ， -GCGATGATCAGATCTCAGCCGATCCTGGG-3，；用HindIII和Bcll双酶切pX/Ig栽体，将回收的Ig基因的序列与克隆到 T载体上的CD40基因的序列连接，得到CD40Ig融合蛋白表达载体。所述构建CTLA4Ig和CD40Ig双基因克隆载体具体为-.设计重叠延伸的扩增引物，使得所述重叠延伸的扩增引物去除CTLA4Ig 基因中末尾的非编码区，保留CD40Ig基因中末尾的非编码区；所述重叠延伸 的扩增引物为第六引物5， -ATATGGCCACAACCATGGTTCGTCTGCCT-3，，第七 引物5， -AGGCTCTAGAAGCATCCTCGTG-3';用所述重叠延伸的扩增引物扩增所述含有质粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋 白表达载体中的CTLA4Ig基因和IRES2序列，将产物CTLA4Ig-IRES2序列回 收纯化；用所述重叠延伸的扩增引物扩增所述CTLA4Ig-IRES2和所述CD40Ig融合 蛋白表达载体中的CD40-Ig基因，将扩增产物克隆入T栽体，得到 CTLA4Ig-CD40Ig双基因克隆载体。所述构建pDC 316-CTLA41 g-CD4 01 g质粒具体为用HindIII和BamHI双酶切载体质粒pcDNA3，回收所述栽体质粒pcDNA3 的酶切产物；用HindIII和BamHI双酶切所述CTLA4Ig-CD40Ig双基因克隆栽体中的目的 基因CTLA4Ig-CD40Ig,回收所述目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切产物；连接所述载体质粒pcDNA3的酶切产物和所述目的基因CTLA4Ig-CD40Ig 的酶切产物，转化，挑取单克隆培养，提取转化后的pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；用Hindffl和Xhol双酶切pcDM3-CTU4Ig-CD40Ig质粒，回收所述 pcDM3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒的酶切产物；用HindIII和Sail双酶切载体质粒pDC316,回收所述载体质粒pDC316的 酶切产物；连接所述pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒的酶切产物和所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，其特征在于，包括：　培养人皮肤成纤维细胞并构建含有ＣＴＬＡ４Ｉｇ－ＣＤ４０Ｉｇ双基因腺病毒载体；　所述含有ＣＴＬＡ４Ｉｇ－ＣＤ４０Ｉｇ双基因腺病毒载体体外转染所述人皮肤成纤维细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：魏泓，葛良鹏，孔勇，黄正根，吴军，
申请(专利权)人：重庆宗申军辉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]