【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于fe3o4-agmba@au纳米粒子的侧流免疫分析方法，利用fe3o4-agmba@au优异的表面增强拉曼散射(sers)高特异性定量分析检出新冠病毒抗体。
技术介绍
1、严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2，又称为(sars-cov-2或covid-19)是一种具有包膜的、不分节段的正链单股rna病毒，颗粒呈现圆形或椭圆形，直径为80至120纳米，属于网巢病毒目冠状病毒科。sars-cov-2病毒可通过人类上呼吸道入侵人体，以多种细胞表面表达的ace2为受体达到感染，主要感染的器官包括肺部、心脏、肾脏等多个器官。sars-cov-2病毒进入人体后，会引起先天免疫系统的免疫应答。其中，免疫系统会在病毒复制过程中介入并抑制病毒的传播，包括会产生特异性抗体等。对抗体的识别和使用可以帮助治疗covid-19患者。n蛋白是sars-cov-2早期表达的蛋白之一，对病毒的早期诊断具有重要的价值。以n蛋白作为靶标被应用于检测sars-cov-2的免疫分析中，其中n蛋白被用作特定的生物标志物。n蛋白不仅作为病毒复制过程中产生的主要成分在感染期间大量表达，并且其具有高度抗性，其在sars-cov-2感染过程中在诱导宿主免疫反应中发挥重要作用。为检测sars-cov-2而开发的免疫分析方法通常将n蛋白抗体设置为特异性生物标志物，并被用作诊断sars-cov-2感染进展的重要指标。
2、传统的检测人体内抗体的方法包括沉淀反应、凝集试验补体结合试验；近年主流的方法有标记免疫测定,如酶联免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于针对即时现场检测中抗体检测耗时长、费人力、成本高、无法定量等不足，以fe3o4和极薄的金壳包覆修饰有拉曼探针分子的银纳米粒子相结合作为sers基底和侧流免疫分析的标记物，提供一种具有高灵敏度和特异性等优点的适用于血样中新冠病毒n蛋白抗体的检测方法。
2、所述由fe3o4结合的au包覆的ag纳米粒子探针是具有球-核-壳结构的球形纳米粒子，使用表面修饰有拉曼探针分子的ag颗粒为核，其中ag球形颗粒的直径为30-35nm，au为壳，厚度为1.5-2nm，fe3o4粒子粒径为160-170nm
3、所述fe3o4-agmba@au纳米粒子探针的制备方法和试纸条的组装喷涂，包括以下步骤：
4、1)fe3o4的制备：在烧瓶中加入乙二醇、无水三氯化铁、柠檬酸钠、乙酸钠，在剧烈搅拌下完全溶解。将溶液转至聚四氟乙烯内衬的反应釜中，充分反应后将产物冷却至室温。随后，将产物在磁场作用下用乙醇和超纯水各洗涤三次。
5、2)ag种子的制备：往三口烧瓶中依次加入柠檬酸钠溶液和超纯水，搅拌加热并保持一段时间，然后加入硝酸银溶液，并迅速加入新鲜配制的硼氢化钠溶液，剧烈搅拌下保持一段时间。溶液将由无色转变为黑色，最后转变为棕黄色，即得到银种子溶液。
6、3)制备ag球形纳米粒子：往三口烧瓶中加入柠檬酸钠溶液和超纯水，回流煮沸一段时间后，依次加入银种子与硝酸银溶液，继续回流煮沸，加入柠檬酸钠溶液与硝酸银溶液，回流一段时间后再次加入柠檬酸钠溶液和硝酸银溶液，回流一段时间后冷却至室温，放入紫外暗箱中进行熟化，即得到银纳米颗粒溶液。
7、4)制备拉曼探针分子修饰的银纳米颗粒：向烧瓶中加入一定体积银纳米颗粒溶液和4-巯基苯甲酸的乙醇溶液，磁力搅拌一段时间，即得到拉曼探针分子修饰的银纳米粒子。
8、5)agmba@au的制备：往小瓶中加入超纯水和氯金酸溶液、氢氧化钠溶液、亚硫酸钠溶液。无光静置即得到无色的生长溶液。另取小瓶，加入修饰探针分子的银溶胶、聚乙烯吡咯烷酮溶液、抗坏血酸溶液、氢氧化钠溶液、亚硫酸钠溶液，将上述混合溶液超声振荡一段时间后加入生长溶液。在水浴下加热一段时间。即得到agmba@au纳米粒子。
9、6)fe3o4-agmba@au(mnps)的制备：通过静电组装将agmba@au组装到fe3o4表面。将fe3o4分散到超纯水洗涤多余的盐酸，加入pei溶液。经超声震荡后再用超纯水清洗，取pei改性的fe3o4溶胶，加入一定体积的agmba@au溶胶，超声振荡使agmba@au组装到fe3o4表面。通过磁分离洗去游离的agmba@au，并将组装完成后的产物分散在超纯水中。
10、7)fe3o4-agmba@au表面修饰巯基聚乙二醇羧基(hs-peg-cooh)：称取巯基聚乙二醇羧基用适量水溶解，加入fe3o4-agmba@au溶液。在一定温度下剧烈搅拌。并用pbs离心洗涤三次。
11、8)缀合抗体：向修饰了巯基聚乙二醇羧基的fe3o4-agmba@au中加入一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺溶液，在室温下摇晃一段时间。使用pbs离心洗涤三次。向活化后的溶液加入适量的兔抗人抗体，在室温下摇晃一段时间，使用pbs离心洗涤并分散在重悬浮液中。
12、9)试纸条组装及喷涂：试纸条由pvc基板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组合粘贴合成。在硝酸纤维素膜上使用划膜喷金仪喷涂新冠病毒nucleocapsid蛋白作为测试线(t线)和羊抗兔抗体作为质控线(c线)。
13、在步骤1)中，所述乙二醇体积为80ml，加热温度为60℃，保持时间为15min；称取的无水三氯化铁质量为2.6g，乙酸钠质量为4.0g，柠檬酸钠质量为1.0g。在聚四氟乙烯内衬中反应温度为200℃，反应时间12h；真空干燥为69℃，保持时间12h。
14、在步骤2)中，所述柠檬酸钠溶液浓度为1wt％，体积为20ml；超纯水的电阻为18mω，体积为75ml；加热温度为70℃，保持时间为15min；硝酸银溶液浓度为1％wt，体积为1.7ml；硼氢化钠溶液浓度为0.1％wt，体积为2ml；搅拌时间为2h，温度为70℃。
15、在步骤3)中，所述柠檬酸钠溶液浓度为1wt％，体积为2ml；超纯水体积为75ml；煮沸时间15min；所述种子溶液体积为10ml，硝酸银浓度为1％wt，体积为1.7ml；第二次和第三次加入的硝酸银溶液浓度分别为1％wt，体积为1.7ml，柠檬酸钠溶液浓度为1％wt，体积为2ml；回流煮沸时间为1h，磁力搅拌转速为600r/min。
16、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于Fe3O4-AgMBA@Au纳米粒子的侧流免疫分析方法，其特征在于，包括：取20μL探针溶液加入微孔板中，随后加入40μL运行溶液和40μL的样品溶液，使所有混合溶液混合均匀，在常温下反应15min后，将试纸条的样品垫一端浸没在微孔板内的溶液中；等待20～25min后，用手机拍摄试纸条的颜色，制作标准比色卡；同时使用便携式拉曼光谱仪扫描检测线处的拉曼光谱，以1075cm-1处的拉曼峰值作为纵坐标，人抗新冠病毒N蛋白抗体的浓度作为横坐标，绘制工作曲线，得到线性方程；20μL探针溶液加入微孔板中，随后加入40μL运行溶液和40μL已知浓度的样品溶液，使所有混合溶液混合均匀，在常温下反应15min后，将试纸条的样品垫一端浸没在微孔板内的溶液中；等待20～25min后，用手机拍摄试纸条的颜色，与标准比色卡对比，可以对人抗新冠病毒N蛋白抗体进行半定量检测；同时使用便携式拉曼光谱仪扫描检测线处的拉曼光谱，以1075cm-1处的拉曼峰值带入上述线性方程，即可求得人抗新冠病毒N蛋白抗体浓度。
2.如权利要求1所述的基于Fe3O4-AgMBA@Au纳米粒子的侧流免疫分析方法
3.如权利要求1所述的基于Fe3O4-AgMBA@Au纳米粒子的侧流免疫分析方法，其特征在于Fe3O4-AgMBA@Au纳米粒子探针的合成步骤和试纸条的制作步骤包括以下过程：
4.如权利要求3所述的基于Fe3O4-AgMBA@Au纳米粒子的侧流免疫分析方法，其特征在于在步骤1)中，所述乙二醇体积为80mL，加热温度为60℃，保持时间为15min；称取的无水三氯化铁质量为2.6g，乙酸钠质量为4.0g，柠檬酸钠质量为1.0g；在聚四氟乙烯内衬中反应温度为200℃，反应时间12h；真空干燥为69℃，保持时间12h。
5.如权利要求3所述的基于Fe3O4-AgMBA@Au纳米粒子的侧流免疫分析方法，其特征在于在步骤2)中，所述柠檬酸钠溶液浓度为1％wt，体积为20mL；超纯水的电阻为18MΩ，体积为75mL；加热温度为70℃，保持时间为15min；硝酸银溶液浓度为1％wt，体积为1.7mL；硼氢化钠溶液浓度为0.1％wt，体积为2mL；搅拌时间为2h，温度为70℃。
6.如权利要求3所述的基于Fe3O4-AgMBA@Au纳米粒子的侧流免疫分析方法，其特征在于在步骤3)中，所述柠檬酸钠溶液浓度为1％wt，体积为2mL；超纯水体积为75mL；煮沸时间15min；所述种子溶液体积为10mL，硝酸银浓度为1％wt，体积为1.7mL；第二次和第三次加入的硝酸银溶液浓度分别为1％wt，体积为1.7mL，柠檬酸钠溶液浓度为1％wt，体积为2mL；回流煮沸时间为1h，磁力搅拌转速为600r/min。
7.如权利要求3所述的基于Fe3O4-AgMBA@Au纳米粒子的侧流免疫分析方法，其特征在于在步骤4)所述的4-巯基苯甲酸的乙醇溶液的浓度为1mM，与银溶胶的体积比为1:100。
8.如权利要求3所述的基于Fe3O4-AgMBA@Au纳米粒子的侧流免疫分析方法，其特征在步骤5)所述的生长溶液中超纯水为4.72mL，氯金酸溶液浓度为0.02943M，体积为40μL，氢氧化钠溶液浓度为0.2M，体积为240μL，亚硫酸钠溶液浓度为0.01M，体积为3mL，静置时间为12h；拉曼探针分子修饰的银溶胶体积为4.5mL，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液浓度为5％wt，MW＝10000，K13-18，体积为1mL；抗坏血酸溶液浓度为0.5M，体积为200μL；氢氧化钠溶液浓度为0.5M，体积为200μL；亚硫酸钠溶液浓度为0.1M，体积为200μL；加入生长溶液体积为1mL，水浴温度60℃，时间为4h。
9.如权利要求3所述的基于Fe3O4-AgMBA@Au纳米粒子的侧流免疫分析方法，其特征在于步骤6)中称取的Fe3O4为0.1g，超纯水体积为10ml，盐酸的浓度为0.01M，体积为50ml；超声振荡时间为10min；PEI浓度为1％wt，超声震荡时间为1h；所取经过PEI改性的Fe3O4溶胶为1mL，分散在10mL的超纯水中。
10.如权利要求3所述的基于Fe3O4-AgMBA@Au纳米粒子的侧流免疫分析方法，其特征在于步骤7)中称取的巯基聚乙二醇羧基质量为15mg，加入Ag@Au的体积为10mL，最终体积为15mL，反应温度为37℃，时间为2h，所用P...
【技术特征摘要】
1.一种基于fe3o4-agmba@au纳米粒子的侧流免疫分析方法，其特征在于，包括：取20μl探针溶液加入微孔板中，随后加入40μl运行溶液和40μl的样品溶液，使所有混合溶液混合均匀，在常温下反应15min后，将试纸条的样品垫一端浸没在微孔板内的溶液中；等待20～25min后，用手机拍摄试纸条的颜色，制作标准比色卡；同时使用便携式拉曼光谱仪扫描检测线处的拉曼光谱，以1075cm-1处的拉曼峰值作为纵坐标，人抗新冠病毒n蛋白抗体的浓度作为横坐标，绘制工作曲线，得到线性方程；20μl探针溶液加入微孔板中，随后加入40μl运行溶液和40μl已知浓度的样品溶液，使所有混合溶液混合均匀，在常温下反应15min后，将试纸条的样品垫一端浸没在微孔板内的溶液中；等待20～25min后，用手机拍摄试纸条的颜色，与标准比色卡对比，可以对人抗新冠病毒n蛋白抗体进行半定量检测；同时使用便携式拉曼光谱仪扫描检测线处的拉曼光谱，以1075cm-1处的拉曼峰值带入上述线性方程，即可求得人抗新冠病毒n蛋白抗体浓度。
2.如权利要求1所述的基于fe3o4-agmba@au纳米粒子的侧流免疫分析方法，其特征在于所述的人抗新冠病毒n蛋白抗体标准溶液浓度依次为1、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mg/ml；运行溶液为含有1wt％牛血清白蛋白、1wt％tween-20的ph＝7.4的缓冲溶液。
3.如权利要求1所述的基于fe3o4-agmba@au纳米粒子的侧流免疫分析方法，其特征在于fe3o4-agmba@au纳米粒子探针的合成步骤和试纸条的制作步骤包括以下过程：
4.如权利要求3所述的基于fe3o4-agmba@au纳米粒子的侧流免疫分析方法，其特征在于在步骤1)中，所述乙二醇体积为80ml，加热温度为60℃，保持时间为15min；称取的无水三氯化铁质量为2.6g，乙酸钠质量为4.0g，柠檬酸钠质量为1.0g；在聚四氟乙烯内衬中反应温度为200℃，反应时间12h；真空干燥为69℃，保持时间12h。
5.如权利要求3所述的基于fe3o4-agmba@au纳米粒子的侧流免疫分析方法，其特征在于在步骤2)中，所述柠檬酸钠溶液浓度为1％wt，体积为20ml；超纯水的电阻为18mω，体积为75ml；加热温度为70℃，保持时间为15min；硝酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：李想，吐尔洪江·阿不来提，郭庚辰，夏鸿坤，莫双梦，刘万建，曾景斌，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：
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