【技术实现步骤摘要】
本公开涉及生物医药领域，具体地，本公开涉及一种四价融合蛋白及其应用。
技术介绍
1、肿瘤免疫监视是限制肿瘤生长的重要过程，巨噬细胞、t细胞和自然杀伤细胞(nk)在肿瘤细胞的识别和清除过程中起着重要作用。肿瘤细胞则通过调节一些免疫检查点的表达逃避免疫系统的识别与清除。
2、cd47是天然免疫的免疫检查点，并被广泛认为是一种“不要吃我”的信号，它有助于在生理条件下维持非恶性细胞的免疫耐受性，但这种分子可以帮助不同癌症类型的癌细胞存活。癌细胞利用cd47的“不要吃我”的功能，在表面表达的cd47水平高于非恶性细胞，cd47与信号调节蛋白α(sirpα)结合的启动抑制性信号通路，导致恶性细胞逃避巨噬细胞的吞噬作用。大量研究表明，cd47在不同类型的肿瘤中过度表达，包括骨髓瘤、平滑肌肉瘤、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤，乳腺癌，骨肉瘤，头颈部鳞状细胞癌。
3、pd-l1是适应性免疫的免疫检查点，正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促发具抗原特异性的细胞毒杀性t细胞(cd8+t cell增生)。而细胞程序性死亡受体-1(pd-1)与细胞程序性死亡-配体1(pd-l1)结合，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结cd8+t细胞的增生，而且pd-1还可以借由调节bcl-2基因，控制淋巴结中抗原特异性t细胞的聚积。
4、pd-l1及cd47均在肿瘤细胞中呈现高表达，并且能够被myc同步调节。肿瘤细胞表达的myc能够通过作用于先天性和获得性免疫细胞以及细胞因子来调节肿瘤微环境，激活myc可以
5、cd47作为天然的免疫检查点，在肿瘤微环境中可与巨噬细胞表面的信号调节蛋白α(sirpα)结合，并发出“don't eat me”信号以逃避免疫监视。因此，cd47成为与pd-1/pd-l1联用极具吸引力的目标。然而，2017年，arch oncology终止了抗cd47单克隆抗体ti-061的i/ii期临床试验；2018年，celgene终止了抗cd47单克隆抗体cc-90002治疗aml的临床试验。鉴于cd47的广泛表达，使用抗cd47抗体作为抗癌治疗的潜在问题包括可能的非靶向效应，如贫血。cd47也在造血系统的非恶性细胞表达，包括正常红细胞、衰老红细胞和血小板forty seven的hu47f9-g4单独或与其他抗体结合可能导致正常红细胞意外死亡，可能导致贫血。
6、pd-1/pd-l1抗体具有单药应答率有限(10％～35％)、持续治疗中逐渐出现耐药性或者复发等问题，cd47的加入，不仅是对pd-l1抑制剂的补充和升级，而是兼顾了先天性和适应性抗肿瘤免疫反应，有望成为新一代广谱抗肿瘤疗法。
7、尽管目前很多在研企业已开发出血液毒性较弱或几乎没有血液毒性的抗体，但如何设计出血液毒性弱且疗效较好的cd47靶向药物仍是目研发的重点。
技术实现思路
1、本公开是基于专利技术人的下列发现而完成的：研究发现，pd-l1及cd47均在肿瘤细胞中呈现高表达，肿瘤微环境中cd47以及pd-l1增加与机体的先天性和获得性免疫抑制相关，导致肿瘤增生，因此，专利技术人研发了pd-l1以及cd47抗体，并利用上述单抗设计了多种融合蛋白，每种融合蛋白中包含4个pd-l1纳米抗体(vhh)，通过对构建的融合蛋白进行体内、外结检测实验，获得了多种与pd-l1以及cd47具有良好的结合活性，可以有效阻断细胞表面pd-l1以及cd47与其对应受体之间的结合，并促进t细胞分泌细胞因子的融合蛋白，所述融合蛋白可以有效治疗或预防肿瘤。
2、由此，在本公开的第一方面，本公开提出了一种融合蛋白。根据本公开的实施例，所述融合蛋白包括第一抗原结合区，所述第一抗原结合区的数量为4个，每个所述第一抗原结合区包括具有pd-l1分子结合活性的vhh，所述vhh具有seq id no:4中的互补决定区；所述互补决定区根据kabat、imgt、chothia、contact或abm定义方式所定义；和第二抗原结合区，所述第二抗原结合区具有cd47分子的结合活性。根据本公开实施例的融合蛋白与pd-l1以及cd47具有良好的结合活性，可以有效阻断肿瘤细胞表面pd-l1以及cd47与其对应受体之间的结合，但对红细胞、血小板等表达cd47蛋白的正常细胞的功能无显著影响，所述融合蛋白能够有效预防或治疗肿瘤。
3、在本公开的第二方面，本公开提出了一种多特异性结合分子，其含有前述的融合蛋白。
4、在本公开的第三方面，本公开提出了一种核酸分子。根据本公开的实施例，所述核酸分子编码第一方面所述的融合蛋白或第二方面所述的多特异性结合分子。根据本公开实施例的核酸分子编码的融合蛋白或多特异性结合分子与pd-l1以及cd47具有良好的结合活性，可以有效阻断肿瘤细胞表面pd-l1以及cd47与其对应受体之间的结合，但对红细胞、血小板等表达cd47蛋白的正常细胞的功能无显著影响，所述融合蛋白或多特异性结合分子能够有效预防或治疗肿瘤。
5、在本公开的第四方面，本公开提出了一种表达载体。根据本公开的实施例，所述表达载体包含前面所述的核酸分子。根据本公开实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的融合蛋白或多特异性结合分子的表达，进而实现所述融合蛋白或多特异性结合分子的大量获得。
6、在本公开的第五方面，本公开提出了一种重组细胞。根据本公开的实施例，所述重组细胞包含前面所述的核酸分子、表达载体、表达前面所述的融合蛋白或多特异性结合分子。根据本公开实施例的重组细胞可用于前面所述的能够结合cd47和pd-l1蛋白的融合蛋白或多特异性结合分子的体外表达和大量获得。
7、在本公开的第六方面，本公开提出了一种组合物。根据本公开的实施例，包括前面所述的融合蛋白、多特异性结合分子、核酸分子、表达载体或重组细胞。如前所述，根据本公开实施例的所述核酸分子、表达载体或重组细胞在合适条件下表达获得的融合蛋白或多特异性结合分子均可以有效与cd47和pd-l1蛋白进行结合，阻断肿瘤细胞表面pd-l1以及cd47与其对应受体之间的结合，但对红细胞、血小板等表达cd47蛋白的正常细胞的功能无显著影响，所述融合蛋白或多特异性结合分子能够有效预防或治疗疾病，进一步地，所述包含上述物质的组合物同样具有阻断pd-l1以及cd47与其对应受体之间结合，但不影响红细胞、血小板的功能的作用，所述组合物也能够有效预防或治疗疾病，如肿瘤。
8、在本公开的第七方面，本公开提出了前面所述的融合蛋白、多特异性结合分子、核酸分子、表达载体、重组细胞或组合物在制备药物中的用途。根据本公开的实施例，所述药物用于预防或治疗疾病。如前所述，所述核酸分子、表达载体或重组细胞在合适条件下表达获得的融合蛋白或多特异性结合分子均可以有效与cd47和pd-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述VHH具有SEQ ID NO:1～3所示的互补决定区；
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合区包括抗CD47的全长抗体或其抗原结合片段；
4.根据权利要求1～3任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括两条相同的第一肽链和两条相同的第二肽链：所述第一肽链和所第二述肽链的氨基酸序列如下(1)-(5)任一项所示：
5.一种多特异性结合分子，其特征在于，其包括权利要求1～4任一项所述的融合蛋白。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～4任一项所述的融合蛋白或其半体，或权利要求5所述的多特异性结合分子。
7.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求6所述的核酸分子。
8.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的表达载体或者表达权利要求1～4任一项所述的融合蛋白或权利要求5所述的多特异性结合分子。
9.一种组合物，其特征在
10.权利要求1～4任一项所述的融合蛋白、权利要求5所述的多特异性结合分子、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的表达载体、权利要求8所述的重组细胞或权利要求9所述的组合物在制备药物或试剂盒中的用途；
...【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述vhh具有seq id no:1～3所示的互补决定区；
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二抗原结合区包括抗cd47的全长抗体或其抗原结合片段；
4.根据权利要求1～3任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括两条相同的第一肽链和两条相同的第二肽链：所述第一肽链和所第二述肽链的氨基酸序列如下(1)-(5)任一项所示：
5.一种多特异性结合分子，其特征在于，其包括权利要求1～4任一项所述的融合蛋白。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～4任一项所述的融合蛋白或其半体，或权利要求5所...
【专利技术属性】
技术研发人员：张轶博，芦迪，霍永庭，欧颖烨，丁姣姣，
申请(专利权)人：广东菲鹏制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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