【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及细胞培养基及其用途。
技术介绍
1、体外培养的非癌性、终末分化人肝细胞(hh)已经成为肝生物学以及各种肝疾病研究的主要体外实验平台。hh也已经是药物代谢和药代动力学(dmpk)临床前评估的基本工具，该评估包括但不限于评价新开发的临床化合物的药物毒性。用于研究用途的hh的全球市场大小估价为5000万美元，并且预计将稳定增长。
2、然而迄今为止，hh的可用性尚未达到满足研究人员的需求的水平。考虑到导致细胞质量迅速损失的细胞获取过程(包括冷热缺血、使用功能胶原酶灌注的分离程序和冷冻/解冻储存过程)，不足之处主要是由于缺乏复杂的hh的体外培养或维持方法。因此，体外培养的hh在肝脏细胞生物学、各种肝疾病和dmpk的研究中存在不期望的性能/功能。
3、此外，还缺乏支持体外成熟hh的长期细胞命运维持的明确技术，这阻碍了我们对肝的分子/细胞生物学的理解。另外，还缺乏支持干细胞或ips细胞衍生的hh(称为ihep)完全成熟的明确技术。改进体外成熟hh的长期细胞命运维持和ihep的完全成熟将导致肝细胞移植疗法的成功建立。
4、目前，肝移植(lt)是针对由各种类型的慢性肝病，诸如慢性病毒性肝炎(hbv和hcv)、酒精性肝病(ald)、非酒精性脂肪性肝病(nafld)以及多种肝的遗传性疾病引起的终末期肝病诸如失代偿性肝硬化和肝癌的唯一疗法。然而，lt是一种侵入性外科手术，并且全国范围内的器官短缺极大地限制了其效用。另外，lt接受者需要接受终生免疫抑制疗法，这与显著的发病率(包括机会性感染和赘生物的发展)
5、肝细胞移植技术有望在未来取代lt疗法，但仍有许多技术障碍要克服。最重大的技术障碍之一是缺乏允许完全成熟ihep的明确方法。目前可获得的ihep的成熟程度与原代人肝细胞(phh)相比仍还很低。实际上，ihep是由未成熟肝细胞以及胆管细胞样细胞两者组成的异质性细胞群，这表明ihep成熟的程度处于肝双潜能祖细胞的阶段。肝细胞成熟的程度可以通过“肝细胞标志物基因”的表达丰度以及其在内源性鼠肝细胞中表达毒性基因(用于产生人源化肝嵌合小鼠(hlcm)的小鼠品系)的免疫缺陷小鼠的肝中增殖的能力来评估。因此，目前可获得的ihep不能在hlcm宿主小鼠的肝中增殖。因此，对于视线包括ihep的肝祖细胞的最终成熟过程的技术仍然存在很大的未满足需求。
6、本文的所有出版物均通过引用并入，其程度与如同特定地并且单独地指示每个单独的出版物或专利申请通过引用并入相同。以下描述包括可以用于理解本专利技术的信息。并不承认：本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的专利技术相关，或者明确引用或暗含引用的任何出版物是现有技术。
技术实现思路
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1.用于制备来自培养的人肝细胞(HH)的条件化培养基的方法，其包括：
2.权利要求1所述的方法，其中所述HH包括原代人肝细胞(PHH)、从具有人源化肝的嵌合动物衍生的肝细胞或其组合。
3.权利要求2所述的方法，其中从所述具有人源化肝的嵌合动物衍生的所述肝细胞是人源化肝嵌合小鼠衍生的人肝细胞(HLCM-HH)，其获得自从用PHH或用先前分离的HLCM-HH注射到脾中的小鼠衍生的肝。
4.权利要求3所述的方法，其中所述小鼠在获得HLCM-HH之前具有至少10％的更替指数。
5.权利要求1所述的方法，其中所述培养基是二甲基亚砜(DMSO)、二甲基砜(DMSO2)或四亚甲基亚砜(TMSO)补充的肝细胞克隆性生长培养基(dHCGM、d2HCGM或tHCGM)，并且所述HCGM包含以下或基本上由以下组成：标准细胞培养基础培养基、L-脯氨酸、胰岛素、地塞米松、EGF和L-抗坏血酸2-磷酸盐(Asc-2P)。
6.权利要求1所述的方法，其中所述培养基是DMSO、DMSO2或TMSO补充的肝细胞维持培养基(dHMM、d2HMM、tHMM)
7.根据权利要求5或6的方法，其中所述标准细胞培养基础培养基选自包括以下的组：Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、RPMI-1640、Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)或William’s E培养基。
8.权利要求7所述的方法，其中所述标准细胞培养基础培养基补充有HEPES、青霉素-链霉素和血清。
9.权利要求7所述的方法，其中所述标准细胞培养基础培养基为DMEM，并且所述DMEM为DMEM-10，并且所述DMEM-10包含以下或基本上由以下组成：DMEM、HEPES、青霉素-链霉素、血清。
10.权利要求8或9中任一项所述的方法，其中所述血清是胎牛血清(FBS)或人血清。
11.权利要求5所述的方法，其中dHCGM、d2HCGM或tHCGM包含以下或基本上由以下组成：在所述标准细胞培养基础培养基中的15μg/mL的L-脯氨酸、0.25μg/mL的胰岛素、50nM的地塞米松、5ng/mL的EGF、0.1mM的Asc-2P、分别为281.6mM、140.8mM或70.4mM的DMSO、DMSO2或TMSO、20mM的HEPES、100IU/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素和10％的血清。
12.权利要求5所述的方法，其中dHCGM、d2HCGM、tHCGM包含以下或基本上由以下组成：在所述标准细胞培养基础培养基中的5-25μg/mL的L-脯氨酸、0.1-0.5μg/mL的胰岛素、10-100nM的地塞米松、1-10ng/mL的EGF、0.01-1mM的Asc-2P、50-300mM的DMSO、DMSO2或TMSO、10-50mM的HEPES、10-300IU/mL的青霉素、10-300μg/mL的链霉素和2-20％的血清。
13.权利要求6所述的方法，其中dHMM、d2HMM或tHMM包含以下或基本上由以下组成：在所述标准细胞培养基础培养基中的15μg/mL的L-脯氨酸、0.25μg/mL的胰岛素、50nM的地塞米松、0.1mM的Asc-2P、分别为281.6mM、140.8mM或70.4mM的DMSO、DMSO2或TMSO、20mM的HEPES、100IU/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素和10％的血清。
14.权利要求6所述的方法，其中dHMM、d2HMM、tHMM包含以下或基本上由以下组成：在所述标准细胞培养基础培养基中的5-25μg/mL的L-脯氨酸、0.1-0.5μg/mL的胰岛素、10-100nM的地塞米松、0.01-1mM的Asc-2P、50-300mM的DMSO、DMSO2、TMSO、10-50mM的HEPES、10-300IU/mL的青霉素、10-300μg/mL的链霉素和2-20％的血清。
15.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中每24至120小时用新鲜体积替换培养基。
16.权利要求2所述的方法，其中所述PHH、从所述具有人源化肝的嵌合动物衍生的所述肝细胞或其组合以0.5×105/cm2至5×105/cm2的细胞密度进行培养。
17.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述HH不包括HepG2细胞、Huh7细胞或鼠肝细胞。
18.权利要求1所述的方法，其中所述HH包括从具有...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.用于制备来自培养的人肝细胞(hh)的条件化培养基的方法，其包括：
2.权利要求1所述的方法，其中所述hh包括原代人肝细胞(phh)、从具有人源化肝的嵌合动物衍生的肝细胞或其组合。
3.权利要求2所述的方法，其中从所述具有人源化肝的嵌合动物衍生的所述肝细胞是人源化肝嵌合小鼠衍生的人肝细胞(hlcm-hh)，其获得自从用phh或用先前分离的hlcm-hh注射到脾中的小鼠衍生的肝。
4.权利要求3所述的方法，其中所述小鼠在获得hlcm-hh之前具有至少10％的更替指数。
5.权利要求1所述的方法，其中所述培养基是二甲基亚砜(dmso)、二甲基砜(dmso2)或四亚甲基亚砜(tmso)补充的肝细胞克隆性生长培养基(dhcgm、d2hcgm或thcgm)，并且所述hcgm包含以下或基本上由以下组成：标准细胞培养基础培养基、l-脯氨酸、胰岛素、地塞米松、egf和l-抗坏血酸2-磷酸盐(asc-2p)。
6.权利要求1所述的方法，其中所述培养基是dmso、dmso2或tmso补充的肝细胞维持培养基(dhmm、d2hmm、thmm)，并且所述hmm包含以下或基本上由以下组成：标准细胞培养基础培养基、l-脯氨酸、胰岛素、地塞米松和l-抗坏血酸2-磷酸盐(asc-2p)。
7.根据权利要求5或6的方法，其中所述标准细胞培养基础培养基选自包括以下的组：dulbecco改良eagle培养基(dmem)、最小必需培养基(mem)、rpmi-1640、iscove改良dulbecco培养基(imdm)或william’s e培养基。
8.权利要求7所述的方法，其中所述标准细胞培养基础培养基补充有hepes、青霉素-链霉素和血清。
9.权利要求7所述的方法，其中所述标准细胞培养基础培养基为dmem，并且所述dmem为dmem-10，并且所述dmem-10包含以下或基本上由以下组成：dmem、hepes、青霉素-链霉素、血清。
10.权利要求8或9中任一项所述的方法，其中所述血清是胎牛血清(fbs)或人血清。
11.权利要求5所述的方法，其中dhcgm、d2hcgm或thcgm包含以下或基本上由以下组成：在所述标准细胞培养基础培养基中的15μg/ml的l-脯氨酸、0.25μg/ml的胰岛素、50nm的地塞米松、5ng/ml的egf、0.1mm的asc-2p、分别为281.6mm、140.8mm或70.4mm的dmso、dmso2或tmso、20mm的hepes、100iu/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素和10％的血清。
12.权利要求5所述的方法，其中dhcgm、d2hcgm、thcgm包含以下或基本上由以下组成：在所述标准细胞培养基础培养基中的5-25μg/ml的l-脯氨酸、0.1-0.5μg/ml的胰岛素、10-100nm的地塞米松、1-10ng/ml的egf、0.01-1mm的asc-2p、50-300mm的dmso、dmso2或tmso、10-50mm的hepes、10-300iu/ml的青霉素、10-300μg/ml的链霉素和2-20％的血清。
13.权利要求6所述的方法，其中dhmm、d2hmm或thmm包含以下或基本上由以下组成：在所述标准细胞培养基础培养基中的15μg/ml的l-脯氨酸、0.25μg/ml的胰岛素、50nm的地塞米松、0.1mm的asc-2p、分别为281.6mm、140.8mm或70.4mm的dmso、dmso2或tmso、20mm的hepes、100iu/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素和10％的血清。
14.权利要求6所述的方法，其中dhmm、d2hmm、thmm包含以下或基本上由以下组成：在所述标准细胞培养基础培养基中的5-25μg/ml的l-脯氨酸、0.1-0.5μg/ml的胰岛素、10-100nm的地塞米松、0.01-1mm的asc-2p、50-300mm的dmso、dmso2、tmso、10-50mm的hepes、10-300iu/ml的青霉素、10-300μg/ml的链霉素和2-20％的血清。
15.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中每24至120小时用新鲜体积替换培养基。
16.权利要求2所述的方法，其中所述phh、从所述具有人源化肝的嵌合动物衍生的所述肝细胞或其组合以0.5×105/cm2至5×105/cm2的细胞密度进行培养。
17.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述hh不包括hepg2细胞、huh7细胞或鼠肝细胞。
18.权利要求1所述的方法，其中所述hh包括从具有人源化肝的嵌合动物衍生的肝细胞，并且所述方法进一步包括在所述培养步骤之前获得从所述具有人源化肝的嵌合动物衍生的所述肝细胞，其中获得从所述具有人源化肝的嵌合动物衍生的所述肝细胞，包括：分离从用phh或用先前分离的从人源化肝嵌合动物衍生的肝细胞注射到所述动物的脾中的动物的肝衍生的干细胞，从而获得从所述具有人源化肝的嵌合动物衍生的所述肝细胞。
19.权利要求18所述的方法，其中经由对所述嵌合动物的肝的胶原酶灌注来分离从所述嵌合动物衍生的所述肝细胞，并且所述嵌合动物在hh分离之前具有至少10％的更替指数。
20.来自培养的人肝细胞的条件化培养基(cmhh)，其通过根据权利要求1-19中任一项所述的方法制备。
21.cmhh，其中所述cmhh包括肝细胞克隆性生长培养基或肝细胞维持培养基，其中所述培养基已经用于培养原代人肝细胞(phh)、从具有人源化肝的嵌合动物衍生的肝细胞或其组合达至少1小时。
22.权利要求21的cmhh，其中所述cmhh包含由人肝细胞分泌的一种或多种体液因子，以及肝细胞克隆性生长培养基或肝细胞维持培养基。
23.权利要求20-22中任一项所述的cmhh，其中所述肝细胞克隆性生长培养基包括补充有l-脯氨酸、胰岛素、地塞米松、egf、asc-2p、hepes、青霉素、链霉素、血清，以及dmso、dmso2或tmso的标准细胞培养基础培养基。
24.权利要求20-22中任一项所述的cmhh，其中所述肝细胞维持培养基包括补充有l-脯氨酸、胰岛素、地塞米松、asc-2p、hepes、青霉素、链霉素、血清，以及dmso、dmso2或tmso的标准细胞培养基础培养基。
25.组合，其包含权利要求20-24中任一项所述的cmhh，以及细胞外基质。
26.组合，其包含权利要求20-24中任一项所述的cmhh，以及毛喉素、sb431542、dapt、iwp2和ldn193189的五种化学品。
27.权利要求20-24中任一项的cmhh，其用于培养新鲜分离的终末分化的hh、phh、从具有人源化肝的嵌合动物衍生的肝细胞，或来自其他动物物种的原代肝细胞。
28.权利要求20-24中任一项的cmhh，其用于培养冷冻保存的终末分化的hh、phh、从具有人源化肝的嵌合动物衍生的肝细胞，或来自其他动物物种的原代肝细胞。
29.权利要求20-24中任一项的cmhh，其用于将肝双潜能祖细胞(ihep)和/或化学诱导的肝祖细胞分别分化成终末分化的肝细胞、...
【专利技术属性】
技术研发人员：斋藤刚，石田雄二，菅原豪，立野向谷知世，山崎千寻，
申请(专利权)人：南加州大学，
类型：发明
国别省市：
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