【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及含外泌体在内的细胞外囊泡修饰的，具体地说，涉及对细胞外囊泡相关粘附分子敲除和去糖基化操作，并将il12联合抗体共同装载在降低非特异性结合/内吞的细胞外囊泡上的。
技术介绍
1、细胞外囊泡(extracellular vesicles,ev)是细胞生长过程中分泌的具有囊泡状结构的物质，往往在形成过程中可携带细胞内的蛋白、核酸，并且在囊泡膜上或胞外如细胞膜一样携带胞外蛋白。细胞外囊泡膜上蛋白种类非常多，因此细胞外囊泡几乎能与所有细胞不同程度的结合并内吞。
2、对癌症的治疗方式通常结合化学疗法、放射疗法、手术以及标靶治疗等。靶向治疗是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点的治疗方式，可设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，细胞外囊泡是常用的高效药物递送系统，但是其作为药物递送系统时会引起的细胞间通讯功能造成了非必须的非特异性的被细胞结合/内吞，加速清除，因此如何使细胞外囊泡在体内稳定完成药物递送避免被清楚是领域内的重要技术难题。
3、白介素12(il12)属于细胞因子的一种，具有生物活性的il12激活的炎性细胞产生，因此适当的激活这些细胞有助于清除肿瘤细胞，但过度激活会产生严重的副反应，例如，细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，crs)，而低浓度的il12活性不够无法激活免疫系统进而促进肿瘤细胞的清除，因此需要新的方法可以在较安全的浓度范围内即可发挥免疫系统激活能力，对于提高细胞外囊泡的在血液中的存留时间、
技术实现思路
1、为了提高细胞外囊泡的在血液中的存留时间、使其更有效的到达病灶，本专利技术通过对细胞外囊泡相关粘附分子敲除和去糖基化操作，得到降低非特异性结合/内吞的细胞外囊泡，延长其在血液中的存留时间，进一步地，将il12联合抗体共同装载在降低非特异性结合/内吞的细胞外囊泡上，通过囊泡的结构实现il12的“多聚体”模式增强药效，再通过抗体实现靶向，降低il12的起效浓度，提高安全性的同时，也实现了在一定的安全性下抑制肿瘤生长。
2、有益效果：
3、本专利技术通过单独或联合itgb1敲除及去糖基化处理，使细胞外囊泡的非特异性结合/内吞显著降低，即降低了其作为药物递送系统时引起的清除，从而提高了药物的递送效率和最终药效，能更好的让细胞外囊泡靶向病灶；
4、本专利技术通过在细胞外囊泡上成功高效装载细胞因子il12，可以使低清除性的细胞外囊泡进一步地具有激活免疫系统的功能，高效完成目标治疗目的，同时，通过进一步装载抗体可实现上述细胞外囊泡的靶向性，即通过联合细胞外囊泡的itgb1敲除及去糖基化处理、装载细胞因子il12和装载抗体，能够在更高的递送效率下，通过抗体的靶向性将il12靶向到肿瘤部位发挥局部的免疫系统激活功能，il12表达在ev膜表面相对于单分子的il12可发挥聚集效应，显著增加il12的刺激功能，用较低的剂量即可发挥功能，可在体内发挥一定的抑瘤作用，特别是针对高表达gpc3的肝细胞癌。
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1.一种制备降低非特异性结合/内吞的细胞外囊泡(EV)的方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中采用PEI转染试剂瞬转ITGB1 CRISPR/Cas9/gRNA质粒于HEK293F悬浮细胞中，72h后，用APC anti-human ITGB1抗体与细胞共孵育，流式分选APC阴性细胞群，将分选得到的细胞群进行扩大培养，该细胞群为ITGB1敲除HEK293F细胞系。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中用Western Blot方法鉴定ITGB1-EV上ITGB1表达变化。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，NanoLuc以VB220306-1137jmq为载体，构建pFc-TMD(NPTN-TMD)-ICD(EWI-F-ICD)-NanoLuc质粒，与睡美人转座酶表达载体pCMV-(CAT)T7-SB100X共同转染到细胞中，72h后，加入终浓度为100μg/ml的Zeocin抗生素加压，至未稳定转染组细胞全部死亡，细胞扩大培养，5000rpm离
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，受体细胞按0.5E+5个每孔接种到24孔板中，处理后加入50μl NanoLuc检测底物，检测样品NanoLuc活性。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中，按5E+10个/只小鼠的剂量尾静脉注射EV，在5,15,30,60,120,240min时采外周全血取血浆，肝，脾，肺，肾组织匀浆并检测血浆和组织匀浆液中NanoLuc酶活，并利用EV颗粒数浓度-NanoLuc酶活建立标准曲线并回算组织中EV颗粒数浓度。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：还包括步骤(6)，对ITGB1敲除细胞来源EV进行联合去糖基化处理。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中，ITGB1敲除细胞来源EV每2E+10个EV加入10μl PNGase F和100μl 10×Reaction Buffer，用PBS补充体系至1ml，EV浓度为2E+10p/ml 37℃孵育1h，用Western Blot方法检测CD63及GAPDH。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：细胞水平验证去糖基化后EV与受体细胞结合/内吞变化时，用过加入NanoLuc检测底物并检测样品NanoLuc活性来完成。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：体内验证去糖基化对EV在体内主要器官的组织分布情况的影响时，按5E+10个/只小鼠的剂量尾静脉注射EV，在5,15,30,60,120,240min时采外周全血取血浆，肝，脾，肺，肾组织匀浆并检测血浆和组织匀浆液中NanoLuc酶活，并利用EV颗粒数浓度-NanoLuc酶活建立标准曲线并回算组织中EV颗粒数浓度。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：还包括步骤(7)，在EV上装载抗体使其具有一定的靶向功能。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(7)中，以pHEK293_Ultra_Expression_I(Takara)为载体构建pIgkappa-HA-HN3-TMD(PDGFRβ)质粒，通过构建pLenti-HN3-Fc-ITGB1_TMD-ITGB1_ICD-PGK-Blasticidin S-WPRE的慢病毒，或转染体系，稳定感染或转染到ITGB1敲除HEK293F细胞中。
13.根据权利要求12所述的制备方法，还包括步骤(8)，通过对EV同时装载scIL12使其能够激活免疫系统。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于：步骤(8)中，hscIL12和mscIL12以VB220306-1137jmq为载体，构建pIL12-Fc-TMD(NPTN-TMD)-ICD(EWI-F-ICD)-NanoLuc质粒，与睡美人转座酶表达载体pCMV-(CAT)T7-SB100X共同转染到细胞中，HN3慢病毒以及IL12睡美人质粒共同感染/转染到ITGB1敲除HEK293F细胞里，进一步筛选并离心收集细胞上清，纯化得ITGB1-scIL12+HN3+EV，进一步去糖基化后获得ITGB1-scIL12+HN3+DegEV。
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【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种制备降低非特异性结合/内吞的细胞外囊泡(ev)的方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中采用pei转染试剂瞬转itgb1 crispr/cas9/grna质粒于hek293f悬浮细胞中，72h后，用apc anti-human itgb1抗体与细胞共孵育，流式分选apc阴性细胞群，将分选得到的细胞群进行扩大培养，该细胞群为itgb1敲除hek293f细胞系。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中用western blot方法鉴定itgb1-ev上itgb1表达变化。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，nanoluc以vb220306-1137jmq为载体，构建pfc-tmd(nptn-tmd)-icd(ewi-f-icd)-nanoluc质粒，与睡美人转座酶表达载体pcmv-(cat)t7-sb100x共同转染到细胞中，72h后，加入终浓度为100μg/ml的zeocin抗生素加压，至未稳定转染组细胞全部死亡，细胞扩大培养，5000rpm离心30min收集细胞上清，并从上清中纯化ev，建立ev颗粒数浓度-nanoluc酶活标准曲线验证ev的nanoluc活性，用triton x-100及proteinase k处理ev，验证nanoluc在ev中的装载位置。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，受体细胞按0.5e+5个每孔接种到24孔板中，处理后加入50μl nanoluc检测底物，检测样品nanoluc活性。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中，按5e+10个/只小鼠的剂量尾静脉注射ev，在5,15,30,60,120,240min时采外周全血取血浆，肝，脾，肺，肾组织匀浆并检测血浆和组织匀浆液中nanoluc酶活，并利用ev颗粒数浓度-nanoluc酶活建立标准曲线并回算组织中ev颗粒数浓度。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：还包括步骤(6)，对itgb1敲除细胞来源ev进行联合去糖基化处理。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中，itgb1敲除细胞来源ev每2e+10个ev加入10μl pngase f和100μl 10×reaction buffer，用pbs补充体系至1ml，ev浓度为2e+10p/ml 37℃孵育1h，用western blot方法检测cd63及gapdh。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：细胞水平验证去糖基化后ev与受体细胞结合/内吞变化时，用过加入nanoluc检测底物并检测样品nanoluc活性来完成。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：体内验证去糖基化对ev在体内主要器官的组织分布情况的影响时，按5e+10个/只小鼠的剂量尾静脉注射ev，在5,15,30,60,120,240min时采外周全血取血浆，肝，脾，肺，肾组织匀浆并检测血浆和组织匀浆液中nanoluc酶活，并利用ev颗粒数浓度-nanoluc酶活建立标准曲线并回算组织中ev颗粒数浓度。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：还包括步骤(7)，在ev上装载抗体使...
【专利技术属性】
技术研发人员：王伊，杨佳蕾，宋海峰，张晶，董亚南，李俊，薛苗苗，
申请(专利权)人：谛邈生物科技新加坡有限公司，
类型：发明
国别省市：
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