本发明专利技术公开了一种在环状载体上引入目的基因的构建方法，包括步骤：获取目的基因及含双酶切和单酶切位点的环状载体；在目的基因上构建双酶切位点；将环状载体、目的基因及双切酶混合进行双酶切反应，获得双酶切的线性载体和目的基因片段；将双酶切的线性载体和目的基因片段连接反应后得到含目的基因的环状载体；将未参与双酶切反应的环状载体进行单酶切，得到包括无需胶回收的线性载体的单酶切产物混合体系。该构建方法，直接将未进行双酶切反应的环状载体进行单酶切后形成线性载体，使其失去活性，不影响已经引入目的基因的环状载体的后续反应，省去了回收纯化处理，避免了胶回收过程中DNA的损失。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及dna重组技术，尤其涉及一种在环状载体上引入目的基因后且无需胶回收的构建方法。
技术介绍
1、表达载体的构建是基因重组技术的关键步骤，其主要过程是通过扩增目的基因、酶切目的基因与载体、回收酶切的dna片段和连接反应将目的基因的编码序列克隆至载体基因的中，然后将构建好的重组载体转入合适的宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞中的表达。然而，在载体构建过程中，胶回收是最常用的dna回收步骤，也是dna损耗最大的步骤。
2、胶回收是一种dna纯化的方法，具体过程是dna在进行凝胶电泳后，切下目的基因条带与溶胶buffer混合，或者是pcr产物直接与溶胶buffer混合，然后与凝胶过滤柱中的滤膜相结合，洗去杂质后，再将结合的dna洗脱下来。使用试剂盒进行胶回收非常方便，而且能去除dna中混合的蛋白质、非目的基因等杂质，获得纯度较高的dna。但是这个纯化过程会损失dna，而且基因片段越小，损失越大，回收率也就越低。由于载体的构建不仅依赖于dna的质量，还依赖于dna的含量，较少的dna回收率使连接效率大大降低。
3、如果不进行胶回收纯化，那么dna中会含有蛋白及酶切切除的dna片段等杂质。这些dna片段与目的基因、载体具有相同的粘末端，在后续的连接过程中会随机连接至载体上，带来非常高的假阳性背景。另外，未被切开的载体也会造成较高的假阳性背景。两者带来的假阳性率会使连接效率大大降低，需要鉴定更多的克隆来获得成功构建的载体，几乎不能用于dna文库构建。
技术实现思路
<
p>1、基于上述问题，本专利技术所要解决的问题在于提供一种具有连接效率高、dna片段回收损失低且无需胶回收的在环状载体上引入目的基因的构建方法。2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种在环状载体上引入目的基因的构建方法，包括如下步骤：
4、环状载体与目的基因的准备：分别获取环状载体及目的基因，并在所述环状载体上筛选出双酶切位点和单酶切位点；
5、目的基因的pcr扩增反应：以所述目的基因为模板，在含有目的基因的上游引物及下游引物、dna聚合酶的反应体系中进行pcr扩增反应，在所述目的基因两端构建与所述环状载体上的双酶切位点相同的双酶切位点，获得含双酶切位点的目的基因片段；
6、双酶切反应：将所述环状载体、目的基因片段及双切酶混合，通过双切酶分别在所述环状载体以及目的基因片段上各自的双酶切位点进行双酶切，获得双酶切产物混合体系，该双酶切产物混合体系中包括两端分别含双酶切位点粘末端的目的基因片段和线性载体，以及未进行双酶切反应的环状载体；
7、连接反应：往所述混合物体系中加入连接酶，通过连接酶将两端分别含有双酶切位点粘末端的目的基因片段连接到两端分别含有双酶切位点粘末端的线性载体上，获得连接产物混合体系，该连接产物混合体系中包括含目的基因的环状载体及未进行双酶切反应的环状载体；
8、单酶切反应：往连接产物混合体系中加入单切酶，在未进行双酶切反应的环状载体的单酶切位点进行裁切，获得单酶切产物混合体系，该单酶切产物混合体系包括无需胶回收的线性载体及含目的基因的环状载体。
9、上述环状载体构建方法中，所述环状载体为质粒载体、慢病毒载体或腺病毒载体；如，phen1、plko.1 puro、paav-mcs。
10、上述环状载体构建方法中，所述双切酶为ncoi与noti、ndei与ecori或bamhi与hindiii；所述单切酶为sali、agei或acci。
11、上述环状载体构建方法中，所述目的基因为合成dna或pcr扩增片段，如scfv。
12、上述环状载体构建方法中，目的基因的pcr扩增反应中，还包括如下步骤：
13、分别设计目的基因对应5’端的上游引物和对应3’端的下游引物，并在上游引物、下游引物分别设计酶切位点；
14、以目的基因为模板，将包含上游引物、下游引物和dna聚合酶进行pcr扩增反应，分别将上游引物和下游引物的酶切位点引入目的基因两端，获得含双酶切位点的目的基因片段；
15、其中，所述pcr扩增反应中，包括10～50μlpcr supermix(+dye)溶液、0.1～5μl上游引物、0.1～5μl下游引物、0.1～5μl目的基因及0～45μl ddh2o。
16、上述环状载体构建方法中，所述上游引物的核酸序列如seq id no.1所示；所述下游引物为的核酸序列如seq id no.2所示。
17、上述环状载体构建方法中，所述pcr扩增反应中，还包括一下几个处理阶段：
18、(1)预变性：98℃、3min；
19、(2)变性：98℃、10s；
20、(3)退火：55℃、30s；
21、(4)延伸：72℃、30s；
22、(5)最后一次延伸：72℃、5min；循环执行第(2)-(4)步骤30次；
23、保存、备用：4℃。
24、上述环状载体构建方法中，所述双酶切反应步骤中，还包括如下步骤：
25、将0.5～5μg环状载体、75～750ng目的基因片段、0.75～7.5μl双切酶、2.5～50μlrcutsmart酶及0～250μl ddh20混合，获得反应混合液；
26、将反应混合液于37℃温度下反应1～24h后进行双酶切混合液，反应停止后，将双酶切混合液加热到60～100℃，并恒温处理10～30min，使反应体系中酶失活，获得包括两端分别含双酶切位点粘末端的目的基因片段和线性载体以及未进行双酶切反应的环状载体的双酶切产物混合体系。
27、上述环状载体构建方法中，连接反应步骤中，还包括如下步骤：
28、往所述双酶切产物混合物体系中，加入t4连接酶和连接反应buffer溶液，获得混合反应液；其中，所述混合反应液中包括：22～88μl的含双酶切位点粘末端的目的基因片段和线性载体、0.5～2μl连接酶、2.5～10μl连接反应buffer溶液以及0～100μl ddh20；
29、将混合反应液于10～30℃温度下连接反应10min～24h，获得含目的基因的环状载体的连接产物混合体系。
30、上述环状载体构建方法中，单酶切反应步骤中，还包括如下步骤：
31、往连接产物混合体系中加入0.5μl～2μl单切酶，于37℃温度下单酶切反应20min～24h，将未进行双酶切反应的环状载体进行单酶切,获得含无需胶回收的线性载体的单酶切产物混合体系，备用。
32、本专利技术提供的无需胶回收的在环状载体上引入目的基因的构建方法，直接将未进行双酶切反应的环状载体进行单酶切后形成线性载体，使其失去活性，不影响已经引入目的基因(dna片段)的环状载体的后续反应，也就无需对反应液进行回收纯化处理，避免了胶回收过程中dna的损失；同时，极大的缩短了载体构建的时间，提高了连接效率，如，构建载体的时间能缩短3倍本文档来自技高网
...
【技术保护点】
1.一种在环状载体上引入目的基因的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述环状载体为质粒载体、慢病毒载体或腺病毒载体；优选，质粒载体为pHEN1，慢病毒载体为pLKO.1puro，腺病毒载体为pAAV-MCS。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述双切酶为NcoI与NotI、NdeI与EcoRI或BamHI与HindIII；所述单切酶为Sal I、AgeI或AccI。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述目的基因为合成DNA或PCR扩增片段。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，目的基因的PCR扩增反应中，还包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述上游引物的核酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述下游引物的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增反应中，还包括一下几个处理阶段：
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述双酶切反应步骤中，还包括如下步骤：
9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，连接反应步骤中，还包括如下步骤：
10.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，单酶切反应步骤中，还包括如下步骤：
...
【技术特征摘要】
1.一种在环状载体上引入目的基因的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述环状载体为质粒载体、慢病毒载体或腺病毒载体；优选，质粒载体为phen1，慢病毒载体为plko.1puro，腺病毒载体为paav-mcs。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述双切酶为ncoi与noti、ndei与ecori或bamhi与hindiii；所述单切酶为sal i、agei或acci。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述目的基因为合成dna或pcr扩增片段。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：马丽雅，王中胜，刘东，
申请(专利权)人：深圳市先康达生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。