【技术实现步骤摘要】
技术介绍
技术实现思路
0、专利技术概述
1、以前，由本专利技术人领导的研究小组设计了一种用于对高阶条形码化的组合基因文库进行高通量功能分析的系统，称为全体组合遗传学(combinatorial genetic en masse)或combigem。该系统已用于产生例如条形码化的双引导rna(grna)组合的文库和两维或三维条形码化的人类微小rna(mirna)前体的文库，以进一步筛选期望的功能性，参见例如wong等人(nat.biotechnol.2015年9月；33(9)：952-961)、wong等人(proc.nat.acad sci.，2016年3月1日，113(9)：2544-2549)、wo2016/070037和wo2016/115033。另请参见美国专利号9315806。专利技术人现在对combigem系统进行了进一步修饰，并开发了改进的combinseal平台，其提供高阶组合突变体文库每个成员的任何两个相邻基因组件之间的无缝连接。换句话说，该平台不会在每个接合位点处引入任何人工或外来氨基酸序列，从而允许产生大量含有组合突变，同时原本保留野生型蛋白的天然氨基酸序列的蛋白变体。
2、因此，本专利技术首先提供一种改进的高通量基因修饰系统以用于系统地产生和筛选组合突变体。一方面，本专利技术提供一种dna构建体，其在dna链的5’至3’方向上包含：第一iis型限制酶的第一识别位点；dna元件；第二iis型限制酶的第一和第二识别位点，唯一分配给dna元件的条形
3、在本专利技术的另一方面，提供另一种dna构建体：dna构建体在dna链的5’至3’方向上包含：第一iis型限制酶的识别位点；多个dna元件；引物结合位点；以及各自唯一分配给多个dna元件之一的多个条形码，以及第二iis型限制酶的识别位点，其中多个dna元件彼此连接以形成蛋白的编码序列(比如天然或野生型蛋白的编码序列)，而在多个dna元件中的任何两个之间的任何连接点处没有任何外来序列，并且其中多个条形码以其分配的dna元件的相反顺序放置。在一些实施方案中，dna构建体为线性构建体；在其他实施方案中，dna构建体为环状构建体，比如包括基于细菌的dna质粒或dna病毒载体的dna载体。还提供了这种构建体的文库，以包括至少两种可能更多种构建体，每个成员具有不同多核苷酸序列的不同dna元件组和唯一分配的条形码组。
4、在以上和本文所述的任一dna构建体的一些实施方案中，第一iis型限制酶和第二iis型限制酶在切割dna分子后产生相容性末端。在一些实施方案中，第一iis型限制酶为bsai。在一些实施方案中，第二iis型限制酶为bbsi。
5、在另一方面，本专利技术涉及一种用于产生组合基因构建体的方法。方法包括这些步骤：(a)用第一iis型限制酶切割权利要求2的第一dna载体，以释放第一dna片段，所述第一dna片段包含第一dna链段、第二iis型限制酶的第一和第二识别位点以及侧翼为由第一iis型限制酶产生的第一和第二末端的第一条形码；(b)用第二iis型限制酶切割包含启动子的初始表达载体，以线性化启动子3’末端附近的初始表达载体并产生与(a)的dna片段的第一和第二末端相容的两个末端；(c)将(a)的第一dna片段退火并连接到(b)的线性化表达载体中以形成单向复合表达载体，其中第一dna片段和第一条形码可操作地连接于启动子的3’末端；(d)用第一iis型限制酶切割权利要求2的第二dna载体，以释放第二dna片段，所述第二dna片段包含第二dna链段、第二iis型限制酶的第一和第二识别位点以及侧翼为由第一iis型限制酶产生的第一和第二末端的第二条形码；(e)用第二iis型限制酶切割(c)的复合表达载体以线性化第一dna元件和第一条形码之间的复合表达载体并产生与(d)的dna片段的第一和第二末端相容的两个末端；和(f)将(d)的第二dna片段退火并连接到在第一dna元件和第一条形码之间的(e)的线性化复合表达载体中以形成双向复合表达载体，其中第一dna片段、第二dna片段、第二条形码和第一条形码以该顺序可操作地连接于启动子的3’末端，其中第一和第二dna元件编码彼此紧邻的自其n-末端开始的预选蛋白的第一和第二链段，和其中第一和第二dna片段在双向复合表达载体中彼此连接而没有导致在预选蛋白中没有发现的任何氨基酸残基的任何外来核苷酸序列，并且其中第一和第二dna元件中的每一个包含一个或多个突变。
6、在该方法的一些实施方案中，重复步骤(d)-(f)直至第n次，以将包含第n个dna元件、第二iis型限制酶的第一和第二识别位点和第n个条形码的第n个dna片段掺入到n向复合表达载体中，第n个dna元件编码从其c-末端开始的预选蛋白的第n个或倒数第二个链段。方法进一步包括以下步骤：(x)提供最终dna载体，其在第一iis型限制酶的第一和第二识别位点之间包含第(n+1)个dna元件、引物结合位点和第(n+1)个条形码；(y)用第一iis型限制酶切割最终dna载体以释放最终dna片段，所述最终dna片段从5’至3’包含：第(n+1)个dna元件、引物结合位点和侧翼为由第一iis型限制酶产生的第一和第二末端的第(n+1)个条形码；(z)将最终dna片段退火并连接到在步骤(d)-(f)重复第n次之后产生并已被第二ils型限制酶线性化的n向复合表达载体中，以形成最终复合表达载体，其中第一、第二、依此类推直到第n个和第(n+1)个dna元件编码彼此紧邻的自其n-末端开始的预选蛋白的第一、第二、依此类推直到第n个和最后一个链段，和其中第一、第二、依此类推直到第n个和最后一个dna片段在最终复合表达载体中彼此连接而没有导致在预选蛋白中没有发现的任何氨基酸残基的任何外来核苷酸序列，并且其中每个dna元件包含一个或多个突变。
7、在以上或本文所述方法的一些实施方案中，第一iis型限制酶和第二iis型限制酶在切割dna分子后产生相容性末端。在一些实施方案中，第一iis型限制酶为bsai。在一些实施方案中，第二iis型限制酶为bbsi。
8、在另一方面，本专利技术提供一种文库，其包括至少两种可能更多种通过以上和本文所述方法产生的最终复合表达载体。
9、其次，本专利技术提供具有改进的靶上切割和减少的脱靶切割能力的spcas9突变体，其通过使用以上和本文所述改进的高通量基因修饰系统来产生和鉴定。一方面，本专利技术提供一种多肽(优选地为分离的多肽)，其包含用作基本序列的seq id no：1和4-13中任何一个所示本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多肽，其包含SEQ ID NO:1和4-13中任何一个所示的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1的残基1003的残基被取代和对应于SEQ ID NO:1的残基661的残基被取代。
2.权利要求1的多肽，其中对应于SEQ ID NO:1的残基1003的残基用组氨酸取代和对应于SEQ ID NO:1的残基661的残基用丙氨酸取代。
3.权利要求2的多肽，其包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，其中残基1003用组氨酸取代和残基661用丙氨酸取代，其任选地进一步包含在残基926处用丙氨酸进行的取代。
4.权利要求1的多肽，其中对应于SEQ ID NO:1的残基695、848和926的残基用丙氨酸取代，对应于SEQ ID NO:1的残基923的残基用甲硫氨酸取代和对应于SEQ ID NO:1的残基924的残基用缬氨酸取代。
5.权利要求4的多肽，其包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，其中对应于SEQ IDNO:1的残基695、848和926的残基用丙氨酸取代，对应于SEQ ID NO:1的残基923的残基用
6.一种组合物，其包含权利要求1的多肽和生理学上可接受的赋形剂。
7.一种包含编码权利要求1-5中任何一项的多肽的多核苷酸序列的核酸。
8.一种包含权利要求5的核酸和生理学上可接受的赋形剂的组合物。
9.一种包含可操作地连接于编码权利要求1-5中任何一项的多肽的多核苷酸序列的启动子的表达盒。
10.一种包含权利要求9的表达盒的载体。
11.权利要求10的载体，其为病毒载体。
12.一种包含权利要求7的表达盒或权利要求1-5中任何一项的多肽的宿主细胞。
13.一种用于在靶位点切割DNA分子的方法，其包括使包含所述靶DNA位点的所述DNA分子与权利要求1-5中任何一项的多肽以及特异性地结合所述靶DNA位点的短引导RNA(sgRNA)接触，从而使所述DNA分子在所述靶DNA位点处被切割。
14.权利要求13的方法，其中所述DNA分子为活细胞内的基因组DNA，并且其中所述细胞已用编码所述sgRNA和所述多肽的多核苷酸序列进行转染。
15.权利要求14的方法，其中所述细胞已用编码所述sgRNA的第一载体和编码所述多肽的第二载体进行转染。
16.权利要求14的方法，其中所述细胞已用编码所述sgRNA和所述多肽两者的载体进行转染。
17.权利要求15的方法，其中第一和第二载体中的每一个为病毒载体。
18.权利要求16的方法，其中所述载体为病毒载体。
19.权利要求17或18的方法，其中所述病毒载体为逆转录病毒载体。
20.权利要求19的方法，其中所述逆转录病毒载体为慢病毒载体。
...【技术特征摘要】
1.一种多肽，其包含seq id no:1和4-13中任何一个所示的氨基酸序列，其中对应于seq id no:1的残基1003的残基被取代和对应于seq id no:1的残基661的残基被取代。
2.权利要求1的多肽，其中对应于seq id no:1的残基1003的残基用组氨酸取代和对应于seq id no:1的残基661的残基用丙氨酸取代。
3.权利要求2的多肽，其包含seq id no:1中所示的氨基酸序列，其中残基1003用组氨酸取代和残基661用丙氨酸取代，其任选地进一步包含在残基926处用丙氨酸进行的取代。
4.权利要求1的多肽，其中对应于seq id no:1的残基695、848和926的残基用丙氨酸取代，对应于seq id no:1的残基923的残基用甲硫氨酸取代和对应于seq id no:1的残基924的残基用缬氨酸取代。
5.权利要求4的多肽，其包含seq id no:1中所示的氨基酸序列，其中对应于seq idno:1的残基695、848和926的残基用丙氨酸取代，对应于seq id no:1的残基923的残基用甲硫氨酸取代和对应于seq id no:1的残基924的残基用缬氨酸取代。
6.一种组合物，其包含权利要求1的多肽和生理学上可接受的赋形剂。
7.一种包含编码权利要求1-5中任何一项的多肽的多核苷酸序列的核酸。
8.一种包含权利要求5的核...
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