【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微流控细胞分选领域，具体涉及一种基于细胞膜小rna表型的微流控细胞分选方法。
技术介绍
1、small rna(小rna)作为一种生命活动重要的调控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。近年来，研究发现不仅在细胞内，还在细胞膜上发现了相应的小rna，它们在细胞间交流、免疫调解、稳态等方面也具有重要的功能。
2、使用下一代测序技术的小rna测序(srna-seq)是已知或未知小rna序型分析和发现的重要研究手段。但针对群体细胞的srna-seq只能获得平均信息，细胞间具有异质性，无法研究不同细胞间细胞膜小rna表型的差异。细胞膜小rna的产生通常受到胞内基因的调控，无法揭示细胞转录组在细胞膜小rna形成过程中的作用。因此将具有不同表型细胞膜小rna的细胞分选为不同的亚群在进一步研究小rna的过程中是必要的。
3、目前，依据目标物的表型进行细胞分选的微流控技术比较成熟，其中最常用的是荧光激活细胞分选技术，该方法通常是对细胞上的目标物进行荧光标记，在细胞流动过程中，不同荧光强度的细胞会受到不同的电场力，从而依据荧光强度的差异分选出目标物表型不同的细胞亚群。但是该技术存在以下问题：1)只能分选荧光强度大的细胞，当目标物的表型较低时，细胞受到的电场力小，无法对该类细胞实现高效分选；当不同细胞间的目标物表型差异较小时，细胞所表现的荧光强度差异较小，难以将其分为不同的亚群。另外，荧光激活细胞分选技术只能分选2-4个细胞亚群。2)在分选时，细胞会受到高电压和高流速带
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种基于细胞膜小rna表型的微流控细胞分选方法，用以解决现有微流控芯片结合外加磁场技术不适用于细胞膜小rna的分选的问题。
2、本专利技术具体通过以下技术方案实现：
3、本专利技术的第一个方面，公开了一种基于细胞膜小rna表型的微流控细胞分选方法，用探针2识别细胞膜小rna，然后将特异性识别的细胞膜小rna与带有探针1的链霉亲和素磁珠杂交，再将完成杂交的细胞流入微流控芯片，实现不同区域对不同细胞表型亚群的分选；
4、其中，所述探针1的5’端结合有生物素，3’端结合有荧光染料；所述探针2由5’端50个碱基的细胞膜小rna识别区、10个碱基的间隔区和3’端22个碱基用于杂交探针1区组成；所述微流控芯片的微流体通道宽度呈梯度变化。
5、优选地，探针1的序列如seq id no.1所示。
6、优选地，探针2的序列如seq id no.2所示。
7、优选地，所述荧光染料为cy5或alex488。
8、优选地，所述微流控芯片捕获柱的高度为50μm。
9、优选地，所述微流控芯片通过软光刻技术制备得到。
10、优选地，还包括探针3，所述探针3的5’端22个碱基杂交识别探针2，3’端20个碱基杂交探针1。
11、进一步优选地，探针3的序列如seq id no.3所示。
12、优选地，探针2和探针3的终浓度比为1:1。
13、进一步优选地，探针2和探针3的终浓度均为1.5μm。
14、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
15、本专利技术提供的一种基于细胞膜小rna表型的微流控细胞分选方法，探针1的5’端结合有生物素，能够快速且稳定地结合链霉亲和素，3’端结合有荧光染料，能够通过荧光强度得知磁珠数量。探针2的5’端的细胞膜小rna识别区域能够特异性识别细胞膜小rna，10个碱基的间隔区能够减少空间位阻，3’端用于杂交探针1的区域够杂交细胞膜表面不同的小rna。微流控芯片的微流体通道宽度呈梯度变化，通过通道宽度的不断增加，能够保证分选过程中不同区域有不同的流速，进而使细胞受到不同的作用力，从而满足捕获和分选细胞的要求。该方法利用探针2使细胞膜小rna被识别，利用带磁珠的探针1与被特异性识别的细胞膜小rna杂交，特异性磁标记细胞膜小rna，将其表型转化为对应的磁场强度，在外加磁场的条件下结合流速线性变化的微流控芯片，实现对不同表型细胞膜小rna细胞亚群的分选，操作简便，分选效果好，为揭示不同表型细胞膜小rna的产生和相应的调控机制提供了新方法。相较于目前常用的荧光激活分选技术，本方法巧妙运用微流控磁分选技术，通过对细胞膜小rna特异性磁标记，结合流速线性变化的微流控芯片，能够平衡细胞受到的磁场力和流体作用的力，实现在通道窄流速快的区域捕获表型高的细胞，在通道宽流速慢的区域捕获表型低的细胞。通过设计的核酸探针之间的杂交，对细胞膜小rna进行磁珠标记，即在磁场的作用下能够受到磁场力而被捕获。该方法能够分选表型差异较小的细胞亚群，也不会对细胞产生不可逆的损伤。
16、进一步地，捕获柱的高度为50μm，能够满足对细胞群体的捕获，足够容纳近百个细胞。
17、进一步地，探针3的5’端能与探针2杂交，3’端能与磁珠杂交，从而用于杂交识别探针和磁珠修饰探针，适用不同细胞的分选。
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1.一种基于细胞膜小RNA表型的微流控细胞分选方法，其特征在于，用探针2识别细胞膜小RNA，然后将特异性识别的细胞膜小RNA与带有探针1的链霉亲和素磁珠杂交，再将完成杂交的细胞流入微流控芯片，实现不同区域对不同细胞表型亚群的分选；
2.根据权利要求1所述的一种基于细胞膜小RNA表型的微流控细胞分选方法，其特征在于，探针1的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种基于细胞膜小RNA表型的微流控细胞分选方法，其特征在于，探针2的序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的一种基于细胞膜小RNA表型的微流控细胞分选方法，其特征在于，所述荧光染料为Cy5或Alex488。
5.根据权利要求1所述的一种基于细胞膜小RNA表型的微流控细胞分选方法，其特征在于，所述微流控芯片捕获柱的高度为50μm。
6.根据权利要求1所述的一种基于细胞膜小RNA表型的微流控细胞分选方法，其特征在于，所述微流控芯片通过软光刻技术制备得到。
7.根据权利要求1～6任意一项所述的一种基于细胞膜小RNA表型
8.根据权利要求7所述的一种基于细胞膜小RNA表型的微流控细胞分选方法，其特征在于，探针3的序列如SEQ ID NO.3所示。
9.根据权利要求7所述的一种基于细胞膜小RNA表型的微流控细胞分选方法，其特征在于，探针2和探针3的终浓度比为1:1。
10.根据权利要求9所述的一种基于细胞膜小RNA表型的微流控细胞分选方法，其特征在于，探针2和探针3的终浓度均为1.5μM。
...【技术特征摘要】
1.一种基于细胞膜小rna表型的微流控细胞分选方法，其特征在于，用探针2识别细胞膜小rna，然后将特异性识别的细胞膜小rna与带有探针1的链霉亲和素磁珠杂交，再将完成杂交的细胞流入微流控芯片，实现不同区域对不同细胞表型亚群的分选；
2.根据权利要求1所述的一种基于细胞膜小rna表型的微流控细胞分选方法，其特征在于，探针1的序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种基于细胞膜小rna表型的微流控细胞分选方法，其特征在于，探针2的序列如seq id no.2所示。
4.根据权利要求1所述的一种基于细胞膜小rna表型的微流控细胞分选方法，其特征在于，所述荧光染料为cy5或alex488。
5.根据权利要求1所述的一种基于细胞膜小rna表型的微流控细胞分选方法，其特征在于，所述微流控芯片捕获...
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