本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷（磷酸根）诊断／测定试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定无机磷（磷酸根）浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、辅酶、草酰乙酸、氰化氢、还原型电子受体、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、氰化氢合成酶、甘氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度上升的程度，从而测算出无机磷（磷酸根）的浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本专利技术还涉及测 定无机磷(磷酸根)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定
技术介绍
人体内磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动态平衡， 血中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降低，反之亦然。血浆 中、浓度的乘积保持在一定范围；大约每100毫升血浆钙磷浓度的乘积 为35~~40。当二者乘积大于40时，钙和磷以骨盐形式沉积在骨组织，>70时， 可发生转移性钙化。当乘积<35时，则将妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶 解，影响成骨作用，引起佝偻病或软骨病。血浆、 的恒定，主要受维生 素D，甲状旁腺激素及降钙素的调节。由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析磷酸盐 阴离子(H2P04"， HPO,)。常用的方法有磷钼酸还原法，非还原法，染料结合 法，酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动注射分析法等。决定 性方法是同位素稀释质谱法，WHO推荐的中等实验室测定无机磷的常规方法是 比色法。磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加入非离 子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多，性能比较稳定 的还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二 醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂聚化合物，方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm有光吸收，必须做 标本空白，否则结果偏高。酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下的中性 范围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是:提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还 原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定无机磷(磷酸根)浓度的 方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的无机磷(磷酸根)诊断/测定试 剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进 行无机磷(磷酸根)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实 的推广应用。本专利技术无机磷(磷酸根)浓度测定方法原理如下磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水 氰化氢+ 二氧化碳+2AH2氰化氢合成酶甘氨酸+2八(电子受休) 甘氨酸+水+辅酶甘氨酸脱氢酶乙醛酸+氨+还原型辅酶+JhT 这种方法应用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase; EC 4.1.1.31)酶(偶)联氰化氢合成酶(hydrogen cyanide synthase; EC 1.4.99.5)、 甘氨酸脱氢酶(glycine dehydrogenase; EC 1.4丄10)酶促反应速率比色法/终点 法。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶解无机磷(磷酸根)反应产生二氧化碳，再通过 (偶)联合氰化氢合成酶、廿氨酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没 有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型 辅酶在340nm处吸光度上升的程度 通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算无机磷(磷酸根)的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论 是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒较为理想缓冲液 100mmol/L稳定齐lj 500 mmol/L辅酶 3 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 10000 U/L氰化氢合成酶 12000 U/Ltf氨酸脱氢酶 12000 U/L草酰乙酸 12mmol/L氰化氢 12mmol/L还原型电子受体(AH2) 7mmol/L本专利技术的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、氰化氢合成酶、甘氨 酸脱氢酶、草酰乙酸、氰化氢、还原型电子受体。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂， 直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、草酰乙酸、氰化氢、还原型电子受体。 试剂2缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、氰化氢合成酶、甘氨酸 脱氢酶。辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、氰化氢合成酶、甘氨酸脱氢酶、草酰乙酸、 氰化氢、还原型电子受体在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干 粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、草酰乙酸、氰化氢、还原型电子受体。 试剂2缓冲液、稳定剂、氰化氢合成酶、甘氨酸脱氢酶。试剂3缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。 辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、氰化氢合成酶、甘氨酸脱氢酶、草酰乙酸、氰化氢、还原型电子受体在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒 可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定无机磷(磷酸根)浓度的方法，其 辅酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的-禾中。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一歩的说明。 实施例一本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为单试剂，包括 三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 500 mmol/L辅酶 3 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 10000 U/L氰化氢合成酶 12000 U/L甘氨酸脱氢酶 12000 U/L草酰乙酸 12mmol/L 氰化氢 12mmol/L 还原型电子受体(AH2) 7mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻千燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定:温度37°C ，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1 ， 测试主波长340nm,测试副波长405nm，被测无机磷(磷酸根)样品与试剂的体 积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约O分钟左右，检 测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度人实施例二本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 10Ommol/L稳定剂 50 mmol/L辅酶 3 mmol/L草酰乙酸 12mmol/L氰化氢 12mmol/L还原型电子受体(AH2) 7mmol/L 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L8稳定剂磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶氰化氢合成酶 甘氨酸脱氢酶50 mmol/L 10000 U/L 12000U/L 12000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。在全自动生化分析仪i:设定:温度37°C ，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1 ，测试主波本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酶比色法及酶联法的无机磷（磷酸根）的浓度测定方法，其方法原理如下： 磷酸根＋草酰乙酸 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 二氧化碳＋磷酸烯醇式丙酮酸＋水 氰化氢＋二氧化碳＋２ＡＨ↓［２］ 氰化氢合成酶 甘氨酸＋２Ａ（电子受体） 甘 氨酸＋水＋辅酶 甘氨酸脱氢酶 乙醛酸＋氨＋还原型辅酶＋Ｈ↑［＋］ 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度上升的程度，测算出无机磷（磷酸根）的浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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