本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷（磷酸根）诊断／测定试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定无机磷（磷酸根）浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化钾、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度下降的程度，从而测算出无机磷（磷酸根）的浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)浓度测定方法技术领城本专利技术涉及一种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本专利技术还涉及测定 无机磷(磷酸根)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定
技术介绍
人体内磷的87。/。都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动态平衡，血 中转、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降低，反之亦然。血浆中、 的恒定，主要受维生素D，甲状旁 腺激素及降钙素的调节。由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析磷酸盐阴 离子(H2PCV-， HP042_)。常用的方法有磷钼酸还原法，非还原法，染料结合法， 酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动注射分析法等。决定性方 法是同位素稀释质谱法，WHO推荐的中等实验室测定无机磷的常规方法是比色 法。磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加入非离子 型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多，性能比较稳定的 还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二醇 基苯基醚(TritonX-100)最理想。磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂聚化合物， 方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm有光吸收，必须做标 本空白，否则结果偏高。酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下的中性范 围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原 型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定无机磷(磷酸根)浓度的方法， 同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，采 用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行无机磷(磷 酸根)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本专利技术无机磷(磷酸根)浓度测定方法原理如下磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水 腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶/&+腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+ 二氧化碳+还原型辅酶苹果酸脱氢酶(脱羧化)苹果酸+辅酶这种方法应用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpymvate carboxylase; EC 4丄1.31 )酶(偶)联丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase; EC 2.7.1.40)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase (decarboxylating); EC 1.1,1.38; EC 1.1.1.39; EC 1.1.1.40)酶促反应 比色法。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶解无机磷(磷酸根)反应产生磷酸烯醇式丙 酮酸及二氧化碳，再通过(偶)联合丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)， 从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度，通过测量340nm处吸光 度下降的程度，可以测算无机磷(磷酸根)的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是 单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒 较为理想缓冲液 稳定剂 还原型辅酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶丙酮酸激酶苹果酸脱氢酶草酰乙酸腺苷二磷酸氯化钾10Ommol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 6000 U/L ■0 U/L 10000U/L 12 mmol/L 10 mmol/L 3 mmol/L本专利技术的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、 苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化钾。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化钾。 试剂2缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶。还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化钾在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干 粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化钾。 试剂2缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶、草酰乙 酸、腺苷二磷酸、氯化钾在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可 以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定无机磷(磷酸根)浓度的方法，其还 原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一歩的说明。实施例一本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为单试剂，包括 三(羧甲基)氨基甲烷 一 盐酸缓冲液 100 mmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶丙酮酸激酶苹果酸脱氢酶草酰乙酸腺苷二磷酸氯化钾6000 U/L 8000 U/L 10000 U/L 12 mmol/L 10 mmol/L 3 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加 入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8 ±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷(磷酸根)样品与试 剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右， 检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340rmi吸光度下降的程度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小。 实施例二木实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 草酰乙酸 腺苷二磷酸 氯化钾 试剂2100mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 12 mmol/L 10 mmol/L 3 mmol/L三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000 U/L丙酮酸激酶 8000 U/L苹果酸脱氢酶 10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动牛化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8 ±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷(磷酸根)样品与试 剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷（磷酸根）浓度测定方法，其方法原理如下： 磷酸根＋草酰乙酸 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 二氧化碳＋磷酸烯醇式丙酮酸＋水 腺苷二磷酸＋磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸激酶／Ｋ↑［＋］ 腺苷三磷酸＋丙酮酸 丙酮酸＋二氧化碳＋还原型辅酶 苹果酸脱氢酶（脱羧化） 苹果酸＋辅酶 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度下降的程度，测算出无机磷（磷酸根）的浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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