【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种恒温检测b族链球菌及内参核酸的体系、方法和应用。
技术介绍
1、b族链球菌(gbs)也被称为无乳链球菌，是革兰氏阳性细菌，通常定植在胃肠道、会阴和阴道。它们会引发任何年龄患者的侵袭性感染，但常见于新生儿、老年人和有易感因素的成人(如妊娠、糖尿病和免疫力低下)，能够引起新生儿肺炎、脓毒症和脑膜炎等严重感染甚至死亡，也能引起产妇的多种疾病，如早产、胎膜早破和绒毛膜羊膜炎等，因此，gbs的检测和预防至关重要。gbs检测是目前在孕中晚期进行常规检测的项目，目的是为了对阳性孕妇进行抗生素干扰，降低新生儿感染的发生率。但是由于目前gbs检测的周转时间较长(1-2天)无法实现产中的实时检测，因此在产中不能及时发现gbs阳性的产妇，从而无法进一步杜绝新生儿gbs感染的发生。
2、目前高灵敏度分子检测的技术以荧光定量pcr为主，该技术经过二十多年的发展，已经非常成熟，并且被广泛应用于各种场景的分子检测。然而，该技术需要配置价格昂贵且不方便携带的仪器方能实现检测，并且检测的时间通常超过40分钟，这些缺点在很大程度上限制了该技术在poct(即时检验，point-of-care)领域的应用。为了解决荧光定量pcr在核酸快速检测了领域的不足，多种在等温条件下进行快速核酸扩增的技术成为近年来研究关注的重点，其中主要技术包括以下几种：转录介导扩增及其衍生技术，由于反应机理的制约，其整体检测时间长，灵敏度也有一定的局限性，无法做到段时间内高灵敏检测；环介导等温扩增具有快速且灵敏的特性，但其抗污染能力弱导致的假
3、所以当前亟需一种能够快速、便捷、具有高灵敏度和高特异性的基于修饰核酸酶的快速检测b族链球菌的方法。
技术实现思路
1、除非上下文另有明确指示，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物。通过端点表述的数值范围包括在对应范围内的所有数值和分数，以及所表述的端点。
2、需要说明的是：
3、“h”指小时，“min”指分钟，“s”指秒，“d”指天,“μl”指微升，“ml”指毫升，“l“指升，“bp”指碱基对，“mm”指毫摩尔，“μm”指微摩尔，ema指恒温核酸扩增技术，mgoac指醋酸镁，peg为聚乙二醇，e1拷贝指10拷贝，e2拷贝指100拷贝，e3拷贝指1000拷贝。
4、dsn酶：是本专利技术涉及的一种可逆的、化学修饰的核酸酶，该可逆性可以通过溶于水后在水中发生修饰基团脱落，或者加热实现；修饰的dsn酶，在未激活之前，对多酶介导的dna扩增无抑制作用；修饰的dsn酶，在未激活之前，对t7 rna聚合酶介导的转录作用无抑制作用；激活后的dsn酶，能在反应体系中降解扩增的双链dna，降低产物导致的后续检测风险；激活后的dsn酶，能在反应体系中降解扩增的rna/dna中的dna探针，而不降解rna，单个rna链上dna探针降解后，新的探针结合上去，该过程可以反复进行；用2,3-二甲基或其他类似化合物修饰的dsn，可以通过冻干等方式保持其修饰状态，在水溶液在其活性恢复状态取决于其修饰的比例；用2-甲基或其他类似化合物修饰的dsn，可以通过加热恢复活性状态，加热时间及温度取决于其修饰的比例。dsn酶可以被其他双链特异性nuclease替代，这类酶可以特异性切除双链dna，或者dna/rna杂合链中的dna链；dsn活性封闭的方法，除了马来酸或其衍生物，也可以被其他化学试剂所替代；或者被特异性抗体，或有dna，rna或dna与rna杂合的适配体；或者将dsn酶与扩增体系分离到不同腔体，在扩增反应结束后，通过混合的方法，将dsn加入扩增产物中；和dsn同时作为探针切除酶以及双链dna水解酶不同，可以用两个或者更多的酶，并且修饰，使得核酸扩增结束后，探针切除酶才发挥功能，核酸检测完成后，双链dna水解酶才发挥功能。
5、本专利技术主要通过以下方法进行b族链球菌(gbs)及内参核酸的检测：
6、(1)在恒温扩增条件下(多酶介导恒温扩增)，实现gbs靶标核酸以及内参核酸在互不干扰的情况下特异性的指数级的扩增；
7、(2)在一条gbs靶核酸的引物中引入t7 rna启动子，使得扩增双链dna中含有t7rna启动子；
8、(3)dna在持续进行指数级扩增的同时，t7 rna聚合酶识别t7启动子，进行对靶标序列的转录；
9、(4)在扩增窗口期结束后，修饰的核酸酶活性启动，识别与rna特异性结合的探针并切割产生荧光信号，该切除探针过程反复进行，提高了反应的信号强度；
10、(5)核酸酶活性启动后，非特异性识别并降解双链dna，消除核酸扩增的产物积累及潜在的污染风险；
11、(6)针对内参核酸扩增的dna，核酸外切酶ⅲ(exonucleaseⅲ，即exoⅲ)和exo荧光探针(根据酶的名称命名为exo探针)可触发荧光信号的升高。
12、本专利技术针对现有技术存在的问题，提供了一种恒温检测b族链球菌及内参核酸的体系、方法和应用。
13、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
14、一方面，本专利技术提供了一种恒温检测b族链球菌及内参核酸的体系，包括扩增cfb基因的引物对cfb-f1和cfb-r1及检测cfb基因的探针、扩增atpd基因的引物对atpd-f1和atpd-r1及检测atpd基因的探针、ema重组酶、ema聚合酶、mgoac、ema缓冲液、rna转录酶、修饰核酸酶和核酸外切酶ⅲ；
15、所述内参为枯草芽孢杆菌。
16、所述cfb基因为b族链球菌中的基因。
17、所述atpd基因为内参核酸中的基因。
18、所述引物对cfb-f1、cfb-r1及检测cfb基因的探针分别具有seq id no:1、seqidno:2和seq id no:3所示的核苷酸序列；所述引物cfb-f1或cfb-r1的5’端带有rna聚合酶启动子。
19、所述引物对atpd-f1和atpd-r1及检测atpd基因的探针分别具有seq id no:4、seqid no:5和seq id no:6所示的核苷酸序列，其中，检测atpd基因的探针第32位碱基t标记荧光基团，探针第35位碱基t本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种恒温检测B族链球菌及内参核酸的体系，其特征在于：包括扩增CFB基因的引物对CFB-F1和CFB-R1及检测CFB基因的探针、扩增ATPD基因的引物对ATPD-F1和ATPD-R1及检测ATPD基因的探针、EMA重组酶、EMA聚合酶、MgOAc、EMA缓冲液、RNA转录酶、修饰核酸酶和核酸外切酶Ⅲ；所述内参为枯草芽孢杆菌；所述CFB基因为B族链球菌中的基因；所述ATPD基因为内参核酸中的基因；
2.根据权利要求1所述的体系，其特征在于：所述的荧光基团包括但不限于FAM、FITC、TET、HEX、JOE、罗丹明类、ROX、AlexaFluor染料、ATTO染料、DyLight染料、cyanine染料、FluoProbes染料、Sulfo Cy染料、Seta染料、IRIS染料、SeTau染料、SRfluor染料或Square染料；所述的淬灭基因包括但不限于DABCYL、TAMRA、MGB、BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3。
3.根据权利要求1所述的体系，其特征在于：所述的RNA聚合酶启动子包括T7 RNA启动子；所述的修饰核酸酶为DSN酶，
4.一种权利要求1-3任一项所述的体系在制备恒温检测B族链球菌及内参核酸试剂盒中的应用。
5.一种恒温检测B族链球菌及内参核酸的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-3任一项所述的体系。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：包括检测试剂冻干粉、激活液、阳性对照、阴性对照、内参对照；所述试剂冻干粉包含引物对CFB-F1、CFB-R1及检测CFB基因的探针、引物对ATPD-F1和ATPD-R1及检测ATPD基因的探针、EMA重组酶、EMA聚合酶、MgOAc、EMA缓冲液、PEG20000、海藻糖、甘露醇、RNA转录酶、修饰核酸酶、核酸外切酶Ⅲ；所述激活液包含dNTP、rNTP、氯化钾、乙酸镁；所述的阳性对照为GBS阳性菌液，阴性对照为TE缓冲液；所述的内参对照为枯草芽孢杆菌。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中的试剂为冻干体系。
8.一种采用权利要求5-7任一项所述的试剂盒恒温检测B族链球菌及内参核酸的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述的扩增温度为30-48℃；所述荧光检测的条件为：温度控制0-100℃，每隔0.1-120分钟检测一次，持续时间为10-180分钟。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述检测的标准包括：先验证测试有效，再对不同浓度样品的Ct值进行阴阳性判定，当B族链球菌的Ct值≤30且内参核酸的Ct值≤15，判断为阳性；当B族链球菌的Ct值显示undet且内参核酸的Ct值≤15，判断为阴性。
...【技术特征摘要】
1.一种恒温检测b族链球菌及内参核酸的体系，其特征在于：包括扩增cfb基因的引物对cfb-f1和cfb-r1及检测cfb基因的探针、扩增atpd基因的引物对atpd-f1和atpd-r1及检测atpd基因的探针、ema重组酶、ema聚合酶、mgoac、ema缓冲液、rna转录酶、修饰核酸酶和核酸外切酶ⅲ；所述内参为枯草芽孢杆菌；所述cfb基因为b族链球菌中的基因；所述atpd基因为内参核酸中的基因；
2.根据权利要求1所述的体系，其特征在于：所述的荧光基团包括但不限于fam、fitc、tet、hex、joe、罗丹明类、rox、alexafluor染料、atto染料、dylight染料、cyanine染料、fluoprobes染料、sulfo cy染料、seta染料、iris染料、setau染料、srfluor染料或square染料；所述的淬灭基因包括但不限于dabcyl、tamra、mgb、bhq-0、bhq-1、bhq-2或bhq-3。
3.根据权利要求1所述的体系，其特征在于：所述的rna聚合酶启动子包括t7 rna启动子；所述的修饰核酸酶为dsn酶，具体地，通过2,3-二甲基马来酸酐或柠康酸酐2-甲基马来酸酐进行修饰。
4.一种权利要求1-3任一项所述的体系在制备恒温检测b族链球菌及内参核酸试剂盒中的应用。
5.一种恒温检测b族链球菌及内参核酸的试剂盒，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴尧，史才雪，李秋实，
申请(专利权)人：苏州晶睿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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