本发明专利技术公开了一种有机物雌激素受激动和拮抗体作用的识别方法。利用分子动力学手段，计算与分析有机物与雌激素受体结合过程，基于配体结合方式和雌激素配体结合区构象的变化，特别是ＥＲ的ＬＢＤ结构中Ｈ１２螺旋位置的变化，识别有机物是ＥＲ激动剂还是拮抗剂。本发明专利技术可以有效识别有机物的拟／抗雌激素作用，方法成本低廉简便，能够节省大量的人力物力财力，为大规模开展毒害化学品环境安全性评价（ＲＥＡＣＨ）进行提供相应的基础工具与快捷途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及环境可疑内分泌干扰物生物活性的判别预测方法，具体说是基于雌激素受体(estrogen rec印tor， ER) H12螺旋构象的变化来识别有机物雌激 素受体激动和拮抗作用的方法。
技术介绍
近年来，多种天然的和人工合成的化学物质因为能够模拟或抑制体内激素的 作用对人类及其他物种产生严重危害而受到广泛关注。1960s，雷切尔.卡逊在《寂静的春天》 一书中提到一些环境化学物质能够干扰内分泌系统；三十年后，有研究发现，欧美国家成年男子的精子数和精液量大约减少了一半，生殖系统发育异 常和生殖力降低等现象相应增加，经过分析得出造成这主要是由环境内分泌干扰 物特别是环境雌激素等外源性物质影响并损害生物体内分泌系统的结果(Carlsen E， Giwercman A， Keiding N, et al. Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years. Br Med J， 1992, 305: 609-613.)。目前，环境污染 物质对生物内分泌系统的影响和损害己经成为科学家们新的研究热点。环境雌激 素(environmental estrogens,或environmental hormones)是内分泌干f尤物 中较为重要的一种，它们是通过与雌激素受体结合或影响细胞信号途径等其它方 式模拟或部分模仿雌激素，发挥类似雌激素效应的化合物。其中，环境污染物以 与内源性雌激素类似的形式与雌激素受体结合，使受体的构象发生改变，形成配 体-受体复合物，复合物再结合到细胞核内DNA结合域的雌激素响应元素(ERE) 上，诱导或抑制有关调节细胞生长和发育的靶基因的转录，从而对一系列雌激素 依赖性生理生化过程造成影响，产生各种环境拟/抗激素效应的受体介导模式尤 其受到关注。ER受体与配体结合后，自身构型会受配体的影响发生变化而产生改变。配 体与ER结合，可以表现为雌激素激动剂和(或)拮抗剂的作用。通过受体介导 途径产生效应的环境雌激素虽均能与雌激素受体结合，但是在不同生物体组织和 器官内表现出不同的激动或拮抗的作用，不同污染物所表现的ER激动剂效应或 (和)拮抗剂作用都与ER高亲和力的相互作用有关，但其表现出的生物效应却 完全不同。环境中具有拟/抗雌激素效应的有机污染物种类繁多，数目庞大，许 多在结构上与体内天然雌激素没有相似性，而且每年都有大量新化学物产生。因 此，首先面对的挑战是如何快速有效地判断环境污染物是ER激动剂还是拮抗剂，亦或是选择性的激动剂(拮抗剂)，以识别其内分泌干扰作用的类型，以便 进一步阐明其作用机制，为风险管理工作提供科学依据。由于环境中污染物结构各异且数目与日俱增，因财力、人力和时间所限，单纯依赖实验室工作来进行ER激动剂/拮抗剂筛选显然是不现实的，目前迫切需要发展非实验性的环境雌激 素筛选评价方法，对于环境污染物的拟/抗雌激素效应首先进行快速甄别，在此 基础上再进行精细测试和研究。基于分子模拟方法的结构活性相关(Structure Activity Relationship, SAR)技术可在环境雌激素结构与其ER激动/拮抗性之间 架起桥梁，使得解决这一难题成为可能(王连生，韩朔睽.有机污染物的定量结 构-活性相关.1993，北京中国环境科学出版社)。这一方法不受实验条件和测 试仪器的限制，采用各种分子力学和数据挖掘技术来研究和预测化合物的生物活 性，因而在面对大批量化合物时具有尤为明显的优势。随着计算机科学和分子生物学的进步，在利用计算机辅助设计中，目前SAR 方法也从传统的二维模型预测发展为可以根据化合物三维空间构象信息参数和 活性指标建立合适的三维SAR模型(3D-SAR)， P. SCHMIEDER等人(P. SCHMIEDER et al., A reactivity pattern for discrimination of ER agonism and antagonism based on 3-D molecular attributes, SAR and QSAR in Environmental Research, 2002 Vol. 13 (2)， pp. 353-364)通过构建化合物的三 维模型，考虑了化合物柔性的影响，用于区分ER可能的激动剂与拮抗剂，研究 表明与分子体积相关的参数，包括可接近表面和范德华表面的大小对区分ER激 动剂和拮抗剂具有明显的效用。Minutolo等人(F. Minutolo， R. Bellini, et al.， Monoaryl-Substituted Salicylaldoximes as Ligands for Estrogen Receptor |3.丄 Med. Chem., 2008. 51(5): p. 1344-1351.)使用分子对接方法研究了单芳香基取 代的水杨醛肟类化合物与ERP的结合模式。表明中间苯环上的取代物会影响此 类化合物与ER(3的结合能力，其中含氯取代物同ERP具有较好的结合，并在体 内以激动相态存在。但是，这些方法均存在如下先验的理论假设，即化合物的激 动/拮抗性仅取决于其与受体配体结合区(Ligand Binding Domain, LBD)活性 口袋的结合模式，若一批化合物激动/拮抗选择性不仅受控于其与靶标点作用方式，而且还取决于受体LBD构象改变，则所得SAR模型的稳健性和预测能力都 会受到较大影响。最初的研究(Katzenellenbogen, B.S.， Montano, M.M.， etal.， Antiestrogens: mechanisms and actions in target cells,丄Steroid Biochem. Mol. Biol. 1995,53,387-393.)表明，具有抗雌激素效应的化合物一般都具有较长的 尾链，这一尾链的存在会改变这些分子与雌激素受体活性口袋的结合方式。但是 Nettles等人(Nettles KW， Sun丄et al. ， Allosteric control of ligand selectivity between estrogen receptors a and p: implications for other nuclear receptors. Molecular Cell, 2004 13:317-327)的研究表明较小的分子也可能使得结构LBD 区域的构象发生改变，从而使其变为拮抗形态。可见，单纯从活性口袋出发难以 区分有机物的激动/拮抗效应。雌激素配体结合区中由12个a螺旋和一个连接的环状结构构成的三层螺旋 形成了结合配体小分子的疏水口袋。化合物进入疏水口袋与受体结合后可诱导受 体构象变化，使受体C端的a螺旋(Helix12螺旋，H12) /AF2像一个盖子折叠 在口袋的上方，关闭配体进出口袋的通道，稳定受体与配体的结合，同时在受体 中形成了一个新的能与蛋白质(如共激活因子或共抑制因子)相互作用的表面。以 前认为激动剂可以充满活性口袋并诱导了单一的活性构象，但近来晶体结构研究 发现受体活性口袋存在多种活性构象，能够以不同方式适本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种有机物雌激素受体激动和拮抗作用的识别方法，包括以下步骤： （１）根据已有雌激素受体与配体结合方式和其在体内发挥作用，从蛋白质数据库库中选择包含与受测化合物结构类似的雌激素受体晶体结构； （２）构建有机污染物分子的空间结构并进行构型和能量优化，采用分子对接计算可疑环境内分泌污染物与雌激素受体活性口袋结合的作用模式； （３）对构建好的雌激素受体－配体复合物进行分子动力学优化模拟； （４）有机物雌激素受体激动和拮抗作用的识别，分析动力学模拟获得的蛋白质构象与初始构象的区别，计算雌激素受体配体结合区Ｈ１２螺旋附近的氨基酸在动力学模拟过程中的ＲＭＳＤ值随时间的变化，来获得真实环境中配体与雌激素配体结合区的结合模式；计算分子动力学模拟前后的ＥＲ构象差异的ＲＭＳＤ值，比较经分子动力学计算得到可能的环境内分泌干扰物与ＥＲ结合后Ｈ１２螺旋位置与典型的ＥＲ激动和拮抗剂Ｈ１２螺旋位置，可以识别该污染物的激动和拮抗作用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张爱茜，蔺远，彭素芬，刘磊，高常安，韩朔睽，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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