利用小肽使药用蛋白制剂稳定化制造技术

本发明专利技术涉及利用选自Ｇｌｙ－Ｇｌｙ，Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ，Ｇｌｙ－Ｔｙｒ，Ｇｌｙ－Ｐｈｅ，Ｇｌｙ－Ｈｉｓ，Ｇｌｙ－Ａｓｐ，Ｇｌｙ－Ａｌａ，Ａｌａ－Ｇｌｙ，Ａｌａ－Ａｌａ，其衍生物和其混合物的肽稳定剂来稳定的药用蛋白制剂。此外，本发明专利技术还涉及含有红细胞生成素和选自二肽，三肽，四肽，五肽，和其混合物的肽稳定剂的稳定的药用制剂。除了肽稳定剂之外，该制剂可含有表面活性剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用小肽使药用蛋白制剂稳定化专利
本专利技术涉及含有生物活性蛋白和肽稳定剂的稳定的药用制剂。本专利技术进一步涉及含有红细胞生成素和稳定剂的药用制剂，其中的稳定剂是二肽，三肽，四肽，五肽或其混合物。本专利技术的稳定的药用制剂可以含有表面活性剂，如吐温80。专利技术背景随着遗传重组技术的发展，许多蛋白可被用于治疗用途。作为例子的是，目前用于治疗疾病的蛋白包括了红细胞生成素，人凝血因子VIII，凝血因子IX，血红蛋白，胰岛素，干扰素α、β和γ，血管内皮细胞生长因子，白介素2及其它的蛋白。但是由于物理不稳定性(例如变性，聚合物的形成等)和化学不稳定性，例如水解作用，氧化作用和脱酰氨基作用，结果是蛋白可能失去生物活性。蛋白的稳定性进一步受到诸如pH，温度，张力和冻融反复次数等因素的影响。为了确保稳定性，通常治疗用蛋白制剂或是以冻干蛋白的形式提供，仅在使用前将其溶解在独立包装的水溶性稀释剂中，或者以含有提高稳定性的添加物的蛋白溶液形式提供。例如，有利于配制蛋白溶液的添加物，比如像游离氨基酸(例如亮氨酸，色氨酸，丝氨酸，精氨酸和组氨酸)已经在诸如AU 722300；US 5,691,312；US 6,120,761等专利中被建议使用。目前一些商业可获得的蛋白制剂含有蛋白作为稳定剂。例如，利用人血清白蛋白或纯化的明胶来抑制蛋白质溶液中的化学和物理的变化。但是，这些蛋白的添加涉及到除去病毒污染物的复杂过程。冷冻干燥法是另一种用于确保稳定性的方法，但是该方法增加了制备成本，而且因为冻干蛋白必须仅在使用前溶解，所以还增加了错误给药的风险。美国专利US No.5,705,482公开了一种用肽-->Leu-His-Leu稳定的人生长激素(hGH)药物溶液。红细胞生成素是被广泛使用的治疗试剂之一。红细胞生成素是刺激血红细胞形成的34-39kDa的糖蛋白激素。它产生于肾脏，而且一旦产生后，循环至骨髓中并在此刺激原始的前体细胞转化成原红细胞，该原红细胞随后成熟变成血红细胞。在正常的健康状态下，红细胞生成素在血浆中的浓度很低，也就是大约0.01到0.03U/ml，但是当发生缺氧时，也就是运输的氧水平降低时，肾脏会产生更多的红细胞生成素。缺氧可能是例如大量失血，辐射导致的血红细胞的破坏，或者处于高海拔等导致的结果。另外，由于血红细胞负责身体中氧的运输，各种形式的贫血也会引起缺氧。在正常的状态下，红细胞生成素水平的升高刺激了新的血红细胞的产生由此提高氧的水平并且减弱或消除氧不足的情况。与正常情况下对缺氧的纠正相比，慢性肾衰(“CRF”)患者的红细胞生成素生成有限或不生成，所以不能产生足够的血红细胞。由于血红细胞的正常寿命期限大约是120天，所以这种患者的贫血会随着时间递增。在重组红细胞生成素发展之前，肾衰患者经常不得不进行定期的输血以维持最低水平的血红细胞。目前用于给患者治疗的红细胞生成素有几种形式-红细胞生成素α，β，ω和6。红细胞生成素ω是一种将人类基因组红细胞生成素DNA的ApaI片段转化到幼小仓鼠肾(BHK)细胞中进行表达而得到的重组蛋白，在例如美国专利US No.5,688,679中描述了红细胞生成素ω及其表达。此外，EPOω的碳水化合物残基的结构和组合物也已在Nimtz等(Eur.J.Biochem.，213：39，1993)和Tsuda等(Eur.J.Biochem.，188：405，1990)中有所描述。EPOω的平均分子量大约是35kDa，而且含有多种同种型(例如，通过等电聚焦，宽切级分(broad-cut fraction)中大约有6-8个同种型，峰级分中有6个同种型)，这就表示有不同类型和数量的糖基化，特别是不同数量的唾液酸化。EPOω有一个O连接的-->寡糖，每mol糖蛋白中含量低于1mol，并且在氨基酸残基Asn-24，Asn-38，和Asn-83有3个N-糖基化位点，在氨基酸残基Ser-126有O-糖基化位点。此外，如Sytkowski等(Biochem.Biophys.Res.Commun.，176(2)：698-704，1991)所报道的，跟尿液中的人红细胞生成素或红细胞生成素α或β不同的是，EPOω基本上都保持所有的体内生物活性，甚至是经受导致基本上，即使不是完全N-去糖基化的条件以后。尽管商业可获得的EPO制剂通常都有很好的耐受性和稳定性，但是在极端的条件下，这种制剂也可能不稳定且丧失活性。活性的丧失可能是由于保藏用的安瓿表面痕量的重金属，空气氧之类的催化作用使得EPO遭到破坏，也可能是由于EPO分子沉淀在容器壁上，可能由此发生部分的变性。考虑到每个剂量单位中仅含数微克，所以由于吸附作用导致的活性丧失可能是大量的，即使是短时间保存后。此外，外界因素诸如热和光，或者在不含人血制品如白蛋白的制剂中，或在含有防腐剂如苯甲醇的多剂量制剂中也都可能加速活性的丧失。因此，希望有不需要冻干所需蛋白或利用人白蛋白作为稳定剂也能提高稳定性的药用蛋白制剂。专利技术概述在一个具体实施方式中，本专利技术涉及到稳定的药用蛋白制剂，其中该制剂含有生物活性蛋白和选自Gly-Gly，Gly-Gly-Gly，Gly-Tyr，Gly-Phe，Gly-His，Gly-Asp，Gly-Ala，Ala-Gly，Ala-Ala其衍生物和其混合物的肽稳定剂，且该制剂中不含人血清白蛋白。在另一个具体实施方式中，本专利技术涉及稳定的药用蛋白制剂，其中该制剂含有红细胞生成素和选白二肽，三肽，四肽，五肽及其混合物的肽稳定剂，制剂中不含人血清白蛋白。在另一个具体实施方式中，提供了稳定的药用组合物，含有红细-->胞生成素，选自Gly-Gly，Gly-Gly-Gly，Gly-Tyr，Gly-Phe，Gly-His，Gly-Asp，Gly-Ala，Ala-Gly，Ala-Ala,其衍生物和其混合物的肽稳定剂，以及吐温80，且该组合物中不含人血清白蛋白。在下文中将部分地呈现和指出其它的目的和特点。附图简述图1描述了如实施例1所述EPO单独在25℃温育4周和40℃下温育4周(B002)，或在HAS(B001)或吐温80(B003)存在下温育8周后，EPO的回收率(％)。图2描述了如实施例1所述EPO在25℃温育4周和40℃下温育4周，在肽稳定剂存在时(B004-B0012)温育8周后EPO的回收率(％)。图3描述了如实施例1所述EPO在25℃温育4周和40℃下温育4周，在肽稳定剂和吐温80存在时(B0013-B0021)温育8周后EPO的回收率(％)。专利技术详述本专利技术提供稳定的药用蛋白制剂，其中该制剂的稳定是通过利用小肽而达到的。这里所描述的药用蛋白制剂是不含外源蛋白的安全制品。所描述的制剂中用作稳定剂的小肽比传统的稳定剂便宜，而且在制备过程中耗费的成本也要低于冻干产品。此外，通过利用小肽，该药用蛋白制剂不用添加人血清白蛋白或其它的人或动物蛋白如明胶，这些成分可能含有病毒污染物。混合到这里所描述的组合物中的蛋白可以是任何以人为治疗目标的有治疗价值的蛋白。因此，该蛋白包括，不限于红细胞生成素(EPO)，凝血因子VIII，凝血因子IX，粒细胞集落刺激因子(GCSF)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)，血小板生成素，肝素，干扰素α、β和γ，白介素2，卵泡刺激因子，类本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定的药用组合物，含有治疗有效量的生物活性蛋白和选自Ｇｌｙ－Ｇｌｙ，Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ，Ｇｌｙ－Ｔｙｒ，Ｇｌｙ－Ｐｈｅ，Ｇｌｙ－Ｈｉｓ，Ｇｌｙ－Ａｓｐ，Ｇｌｙ－Ａｌａ，Ａｌａ－Ｇｌｙ，Ａｌａ－Ａｌａ，其衍生物和其混合物的肽稳定剂，其中该组合物不含血清白蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2003-10-10 10/683,5491.一种稳定的药用组合物，含有治疗有效量的生物活性蛋白和选自Gly-Gly，Gly-Gly-Gly，Gly-Tyr，Gly-Phe，Gly-His，Gly-Asp，Gly-Ala，Ala-Gly，Ala-Ala，其衍生物和其混合物的肽稳定剂，其中该组合物不含血清白蛋白。2.权利要求1所述的组合物，其中生物活性蛋白选自红细胞生成素，凝血因子VIII，凝血因子IX，粒细胞集落刺激因子，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，干扰素α，干扰素β，干扰素γ，白介素2，卵泡刺激激素，类胰岛素生长因子，神经生长因子，BMP-2，BMP-4，BMP-7和肿瘤坏死因子。3.权利要求2的组合物，其中的生物活性蛋白是来源于重组的。4.权利要求3的组合物，其中的生物活性蛋白是红细胞生成素。5.权利要求4的组合物，其中的生物活性蛋白是红细胞生成素ω。6.权利要求5的组合物，其中在所述组合物中红细胞生成素ω的浓度在大约500IU/ml和大约100,000IU/ml之间。7.权利要求6的组合物，其中红细胞生成素ω的浓度在大约2,000IU/ml和大约20,000IU/ml之间。8.权利要求1的组合物，其中的衍生物包括Gly-Gly，Gly-Gly-Gly，Gly-Tyr，Gly-Phe，Gly-His，Gly-Asp，Gly-Ala，Ala-Gly，和Ala-Ala的盐。9.权利要求1的组合物，其中的血清白蛋白是人血清白蛋白。-->10.权利要求1的组合物，其中在所述组合物中肽稳定剂的浓度是在大约0.01g/L和大约10g/L之间。11.权利要求10的组合物，其中肽稳定剂的浓度在大约0.5g/L和大约5g/L之间。12.权利要求1的组合物，其中在组合物进一步含有表面活性剂。13.权利要求12的组合物，其中的表面活性剂是非离子表面活性剂，阳离子表面活性剂，阴离子表面活性剂，兼性表面活性剂，两性离子表面活性剂，或其混合物。14.权利要求13的组合物，其中的表面活性剂是聚亚氧烷基脱水山梨糖醇脂肪酸酯。15.权利要求12的组合物，其中在所述组合物中表面活性剂的浓度在大约0.0005％w/v和大约0.5％w/v之间。16.一种稳定的含有红细胞生成素和选自二肽，三肽，四肽，五肽及其混合物的肽稳定剂的药用组合物，且其中该组合物不含血清白蛋白。17.权利要求16的组合物，其中的肽稳定剂是二肽。...

【专利技术属性】
技术研发人员：费边萨默斯，迪尔克费，
申请(专利权)人：巴克斯特国际公司，巴克斯特医疗保健股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]