【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，具体涉及一种用于对白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测方法。
技术介绍
1、对虾白斑综合征(white spot syndrome virus，wssv)是由白斑综合征病毒引起的暴发性流行病，白斑综合征病毒可通过水平和垂直传播感染中国明对虾(fenneropenaeus chinensis)、凡纳滨对虾(litopenaeus vannamei)等几乎所有对虾类甲壳动物，对虾生命周期各阶段全部易感，发病病程短，致死率极高。感染白斑综合征病毒对虾甲壳内表面初现点状白斑，继而逐渐扩大至头胸部和全身，致使甲壳呈白色；发病前期虾须、扇尾发红，身体消瘦，漫游于水面，发病后期病虾残胃或空胃，甲壳易脱离真皮，游动缓慢无力，致死率高达100％。白斑综合征病毒造成养殖对虾大规模死亡和巨大经济损失，成为全球对虾养殖业危害最大的一种病毒病。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的检测方法是减少对虾白斑综合征发生和危害的重要途径。
2、目前，对虾是否感染白斑综合征的检验通常采用病理学显微镜观察、生化测定、免疫学试验、细胞培养和pcr等，这些方法耗时、耗力、操作复杂，很难适应当前快速、准确检测的需要。成簇的规则间隔短回文重复序列(crispr)相关(cas)核酸酶方法目前已被应用于病原体检测，这种方法速度快、特异性高且操作简单。crispr/cas12a系统用于检测的原理是：cas12a酶与相应的crrna结合成cas12a-crrna复合体，一旦crrna识别到对应的靶标，cas12a酶就会被
3、微流控芯片(microfluidics)是一种基于微流体界面精确操作的技术，是临床检测前沿最重要的检测和分析技术。通过在10-100微米通道内进行微量流体的操控、处理和反应，达到分子检测的目的。采用微流控芯片可实现对待测标本多种致病核酸的高通量快速检测，对于基于分子生物学的快速诊断发展和重大疫病的快速微量检测和疾病源头的阻断具有重大意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种用于对白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测方法。为了减少交叉污染的机会，申请人将等温lamp扩增和cas12b检测两步集成到一个微流控芯片之中，通过离心式微流控芯片控制靶序列在等温lamp扩增后进入cas12b检测体系检测的同时避免了气溶胶污染。该方法制作成本低、设备小型化、高通量、可同时检测多种样本、检测反应的试剂消耗微量化、分析速度快、灵敏度高，具有操作简单、自动化、集成化等特点。
2、本专利技术的具体技术方案如下：
3、本专利技术提供了一种用于对白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测的引物，所述引物为lamp引物组，包括外引物f3和b3、内引物fip和bip以及环引物lf和lb，具体核苷酸序列如下：
4、
5、
6、本专利技术还提供了一种用于对白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测的crrna，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.25所示。
7、本专利技术还提供了一种用于对白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测的探针，所述探针为：6-fam-ttatt-bhq1。
8、本专利技术还提供了一种用于对白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测的试剂盒，包括所述引物、所述的crrna以及所述的探针。
9、所述的试剂盒还包括微流控芯片，所述微流控芯片包括使用所述引物等温扩增的扩增室，使用所述crrna和所述探针检测的检测室，以及连接所述扩增室与所述检测室的微通道。所述微通道的长度为10-100μm。
10、本专利技术还提供了一种用于对白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测方法，所述方法为非疾病诊断和治疗目的，使用所述的试剂盒进行检测，包括以下步骤：
11、(1)提取待检测样品的dna；
12、(2)在所述微流控芯片的检测室中预先装载包含所述crrna和所述探针的crispr/cas12b检测体系，封底膜；
13、(3)将步骤(1)中提取的待检测样品的dna与含有所述引物的lamp扩增体系混合，然后加入到所述微流控芯片的扩增室中，封顶膜；
14、(4)将完成步骤(2)和步骤(3)的微流控芯片置于微流控检测仪中进行扩增和检测，得到检测产物；
15、(5)将检测产物进行酶标仪荧光检测，出现荧光信号的为阳性，无荧光信号的为阴性。
16、具体的，步骤(2)中所述crispr/cas12b检测体系为：总体积为2.5μl，10×cas12b反应缓冲液0.5μl、1mg/ml aapcas12b蛋白酶0.5μl、600ng/μl crrna 0.2μl、10μm探针0.1μl，余量为ddh2o。
17、具体的，步骤(3)中所述lamp扩增体系为：10×thermopol反应缓冲液2.5μl，10mmdntp 3.5μl，100mm mgso4水溶液1.5μl，10μm fip 1.6μl，10μm bip 1.6μl，10μm f30.2μl，10μm b30.2μl，10μm lf 0.4μl，10μm lb 0.4μl，bst dna聚合酶1.5μl，待检测样品的dna1μl，用ddh2o补至25μl。
18、步骤(4)中，在扩增和检测时，使用同一温度。
19、具体的，步骤(4)中，将上述密封好的微流控芯片置于与其配套的微流控检测仪中，设置程序，先在60℃下进行lamp扩增30min，随后通过三次短时间离心(4600rpm，30s)将lamp扩增产物从扩增室转移至检测室与cas12b检测体系混合，在温度60℃下cas12b检测20min，每分钟进行3次荧光信号收集。
20、本专利技术的有益效果：
21、(1)特异性强：本检测方法通过cas12b与crrna所形成的复合物对扩增后的靶序列进行检测，能特异性的识别并结合目标序列，有效的避免了假阳性本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于白斑综合征的基于LAMP-CRISPR/Cas12b的微流控检测的引物，其特征在于，所述引物为LAMP引物组，包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP以及环引物LF和LB，具体核苷酸序列如下：
2.一种用于白斑综合征的基于LAMP-CRISPR/Cas12b的微流控检测的crRNA，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
3.一种用于白斑综合征的基于LAMP-CRISPR/Cas12b的微流控检测的探针，其特征在于，所述探针为：6-FAM-TTATT-BHQ1。
4.一种用于白斑综合征的基于LAMP-CRISPR/Cas12b的微流控检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物、权利要求2所述的crRNA以及权利要求3所述的探针。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括微流控芯片，所述微流控芯片包括使用所述引物等温扩增的扩增室，使用所述crRNA和所述探针检测的检测室，以及用于连接所述扩增室与所述检测室的微通道。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述微
7.一种用于白斑综合征的基于LAMP-CRISPR/Cas12b的微流控检测方法，所述微流控检测方法为非疾病诊断和治疗目的，其特征在于，使用权利要求5所述的试剂盒进行检测，包括以下步骤：
8.如权利要求7所述的微流控检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述CRISPR/Cas12b检测体系为：总体积为2.5μL，10×Cas12b反应缓冲液0.5μL、1mg/mL AapCas12b蛋白酶0.5μL、600ng/μL crRNA 0.2μL、10μM探针0.1μL，余量为ddH2O；
9.如权利要求7所述的微流控检测方法，其特征在于，步骤(4)中，在扩增和检测时，使用同一温度。
10.如权利要求9所述的微流控检测方法，其特征在于，步骤(4)中，所述扩增的条件为：在温度60℃下扩增30min；所述检测的条件为：在温度60℃下检测20min，每分钟进行3次荧光信号收集。
...【技术特征摘要】
1.一种用于白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测的引物，其特征在于，所述引物为lamp引物组，包括外引物f3和b3、内引物fip和bip以及环引物lf和lb，具体核苷酸序列如下：
2.一种用于白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测的crrna，其特征在于，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.25所示。
3.一种用于白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测的探针，其特征在于，所述探针为：6-fam-ttatt-bhq1。
4.一种用于白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物、权利要求2所述的crrna以及权利要求3所述的探针。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括微流控芯片，所述微流控芯片包括使用所述引物等温扩增的扩增室，使用所述crrna和所述探针检测的检测室，以及用于连接所述扩增室与所述检测室的...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱楚婕，马婷婷，黄春莹，闻东亚，胡可顺，李冰豪，李业，黄俊，陈宇菱，高原，
申请(专利权)人：浙江科技大学，
类型：发明
国别省市：
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