【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，具体涉及一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法及应用。
技术介绍
1、肠道菌群与葡萄糖代谢、脂代谢密切相关，其中部分菌群通过调节胆汁酸(bas)代谢进而影响多个bas受体信号传导途径。肝脏胆固醇经肝酶代谢，合成初级胆汁酸。胆汁酸(bas)拥有多样的化学结构和生物功能，合成途径包括经典途径(主要产生12α-羟基胆汁酸，胆酸)和替代途径(主要产生非12α-羟基胆汁酸，鹅去氧胆酸)。bas合成和排泄是胆固醇和脂代谢的主要途径，因此与多种代谢性疾病有关，包括肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝等。此外，羟化固醇和bas均可作为信号分子，激活多种组织中的多个核和膜受体介导的信号途径，调节葡萄糖，脂质稳态，炎症和能量消耗。调节bas合成和组成以调节bas信号传导是代谢性疾病治疗的潜在策略。
2、12α-羟基胆汁酸(12hbas)/非12α-羟基胆汁酸(非12hbas)的比值增高通常与代谢紊乱有关，如胰岛素抵抗和肝脂肪变性。相反，非12hbas的比例增加有助于减少脂质吸收和改善葡萄糖耐量。此外，熊去氧胆酸(udca)和石胆酸(lca)等非12hbas药物在原发性胆汁性胆管炎、肝纤维化和非酒精性脂肪肝的临床治疗中显示出有益的结果。
3、基于bas的同分异构体众多、标准品有限等特点，想要从复杂的生物基质中准确识别和区分12hbas和非12hbas面临相当大的挑战，目前也无法在不依赖标准品的情况下全局区分12hbas和非12hbas。贾刚田提出过一种血中12α-羟基胆汁酸的微量酶法测定技术，其研究用
4、高分辨质谱(hrms)检测范围广，能提供丰富的结构信息，是鉴定复杂样品中bas的重要技术。众多研究聚焦于特征碎片和化学衍生化技术以实现bas异构体的区分和检测。但是，需要注意的是，只有游离12hbas可以产生明确的特征性碎片，大量结合类型的12hbas无法依赖诊断碎片区分。
5、再者，寻找一种针对特定位点的特异性化学试剂十分困难。王志臻曾在其硕士学位论文“3α-羟类固醇脱氢酶的密码子优化表达、亲和纯化及酶性质研究”中通过优化3α-hsdh基因密码子，合成3α-hsdh基因全序，其以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)为辅基，能可逆地催化类固醇分子中第三位上羟基的氧化与还原。其虽是一种针对特定位点的特异性化学试剂，但是其在临床上主要是用来检测血清中总胆汁酸的含量的关键酶，也不能用于区分和识别12hbas和非12hbas。
6、随着合成生物学的快速发展，拓展了bas代谢反应的解析。为了精确区分12hbas与非12hbas，开发一种生物酶辅助的质谱方法实现12hbas和非12hbas的区分十分有必要。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种肠道微生物编码的12α-羟类固醇脱氢酶(12α-hsdh)辅助的液质联用(lc-ms)方法识别12hbas，从而区分12hbas与非12hbas的方法与应用。
2、本专利技术的技术方案为：一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，该方法基于由迟缓埃格特菌株dsm 2243编码的12α-hsdh进行，并对12α-hsdh基因序列进行密码子优化，优化后的12α-hsdh在体外特异性催化12hbas的脱氢反应，优化后的12α-hsdh全长基因的核苷酸序列如seq id no：1所示；
3、具体检测过程如下：
4、(1)使用两份相同的胆汁酸样品a和b，样品b中投入12α-hsdh溶液和辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)，样品a不加12α-hsdh，用作阴性对照，反应在中性缓冲液中进行；
5、(2)反应混合物中加入有机试剂液液萃取，静置分层后，转移出有机层，吹干，残留物重新溶解在内标溶液中，离心后，上清液进入仪器分析；
6、(3)对上清液进行超高效液相色谱串联质谱分离检测：利用高效液相色谱对步骤(1)制备的样品a和b进行分离，再通过质谱检测样品a和b中的bas质荷比的响应；
7、(4)将步骤(3)采集的数据，使用同位素内标相对定量，得到样品a和b中bas的峰面积a，定义bas的转化率为(1-ab/aa)％，其中，ab为样品b的峰面积、aa为样品a的峰面积，通过bas标准品制定转化率指标识别12α羟基胆汁酸。
8、进一步地，(1-ab/aa)％值在60％-100％的配对峰为12hbas。
9、进一步地，步骤(1)中所用中性缓冲液为ph值6-10的磷酸二氢钾缓冲液或tris-hcl缓冲液，反应在30-50℃下持续6-24小时。
10、进一步地，步骤(2)中所用有机试剂为乙酸乙酯，反应混合物与有机试剂的体积比为1:1～4。
11、进一步地，步骤(3)中，高效液相色谱条件为：色谱柱：waters acquity c18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)；流动相组成：含0.1％甲酸的水(a)和乙腈(b)；流动相b的线性梯度洗脱条件为：5％(0.0-0.5min)，5％至35％(0.5-2.0min)，35％至65％(2.0-35.0min)，65％至100％(35.0-36.0min)，100％(36.0-44.0min)，100％至5％(44.0-45.0min)，然后在5％下停留5.0min，流速设定为0.2ml/min，柱温为35℃，进样体积为2μl。
12、进一步地，步骤(3)中，质谱条件为：在电喷雾电离(esi)模式下，采用dda-ms采集周期为874ms，包括ms1累积时间(100ms，质量扫描范围150-800da)和ms2累积时间(50ms，质量扫描范围50-800da)，离子源在负离子模式下运行，设置如下：离子喷雾电压浮动(isvf)-4500v，离子源气体1(gs1)55psi，离子源气体2(gs2)55psi，帘式气体(cur)40psi，电喷雾离子源温度550℃，除杂电位(dp)-90v，碰撞能量(ce)-45±15v。
13、进一步地，密码子优化后的12α-hsdh全长基因经表达和纯化后得到目标蛋白，表达和纯化过程如下：
14、1)将seq id no.1所示基因克隆至带有n端6×his标签的表达载体中，得到重组质粒；
15、2)将重组质粒转化e.coli bl21(de3)细胞，得到重组表达转化体；
16、3)将步骤2)得到的重组表达转化体大肠杆菌系统中诱导表达；
17、4)采用ni-nta琼脂糖柱纯化目标蛋白。
18、进一步地，步骤本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，该方法基于由迟缓埃格特菌株DSM 2243编码的12α-HSDH进行，并对12α-HSDH基因序列进行密码子优化，优化后的12α-HSDH在体外特异性催化12HBAs的脱氢反应，优化后的12α-HSDH全长基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；
2.如权利要求1所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，(1-Ab/Aa)％值在60％-100％的配对峰为12HBAs。
3.如权利要求1所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，步骤(1)中所用中性缓冲液为pH值6-10的磷酸二氢钾缓冲液或Tris-HCl缓冲液，反应在30-50℃下持续6-24小时。
4.如权利要求1所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，步骤(2)中所用有机试剂为乙酸乙酯，反应混合物与有机试剂的体积比为1:1～4。
5.如权利要求1所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，步骤(3)中，高效
6.如权利要求1所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，步骤(3)中，质谱条件为：在电喷雾电离(ESI)模式下，采用DDA-MS采集周期为874ms，包括MS1累积时间(100ms，质量扫描范围150-800Da)和MS2累积时间(50ms，质量扫描范围50-800Da)，离子源在负离子模式下运行，设置如下：离子喷雾电压浮动(ISVF)-4500V，离子源气体1(GS1)55psi，离子源气体2(GS2)55psi，帘式气体(CUR)40psi，电喷雾离子源温度550℃，除杂电位(DP)-90V，碰撞能量(CE)-45±15V。
7.如权利要求1所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，密码子优化后的12α-HSDH全长基因经表达和纯化后得到目标蛋白，表达和纯化过程如下：
8.如权利要求7所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述表达载体为pET-22b(+)质粒载体。
...【技术特征摘要】
1.一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，该方法基于由迟缓埃格特菌株dsm 2243编码的12α-hsdh进行，并对12α-hsdh基因序列进行密码子优化，优化后的12α-hsdh在体外特异性催化12hbas的脱氢反应，优化后的12α-hsdh全长基因的核苷酸序列如seq id no：1所示；
2.如权利要求1所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，(1-ab/aa)％值在60％-100％的配对峰为12hbas。
3.如权利要求1所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，步骤(1)中所用中性缓冲液为ph值6-10的磷酸二氢钾缓冲液或tris-hcl缓冲液，反应在30-50℃下持续6-24小时。
4.如权利要求1所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，步骤(2)中所用有机试剂为乙酸乙酯，反应混合物与有机试剂的体积比为1:1～4。
5.如权利要求1所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，步骤(3)中，高效液相色谱条件为：色谱柱：waters acquity c18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)；流动相组成：含0.1％甲酸的水(a)和乙腈(b)；流动相b的线性梯度洗脱条件为：5％(0.0-0.5min)，5％至...
【专利技术属性】
技术研发人员：辛贵忠，赵安琪，郑佳逸，王如锋，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：
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