一种促进体外人类精子发生的培养液及培养方法技术

技术编号：41856439 阅读：13 留言：0更新日期：2024-06-27 18:31

本发明专利技术公开了一种促进体外人类精子发生的培养液及培养方法，涉及生物医学技术领域。本发明专利技术与之前的体外人类精子发生的培养液相比，改进了激素调节的方式副作用较大，易影响细胞分化状态，如何进一步完善诱导干细胞获取足量且健康的精子细胞的问题，在培养液中添加各类激素以及脂肪酸等对细胞进行体外诱导、培养和发育，能够提高细胞在体外的生存能力，且通过本发明专利技术培养液的培养方法，能够大大提高数据检测准确率和检测精度，提升数据可靠性，通过本发明专利技术培养液作用于精子细胞的发生全过程；能够促进健康精子的发送和成熟，同时能够保证生成的精子的活力和浓度，为体外男性精子成熟提供技术可能，为治愈无精子症提供平台，恢复患者的生育能力。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学，尤其涉及一种促进体外人类精子发生的培养液及培养方法。

技术介绍

1、据统计，全球育龄夫妇中不孕不育症发病率高达10％～15％，男性不育占比近年来逐渐接近50％。男性不育主要可表现为弱精、畸精、严重少精、无精子症，其中无精子症占男性不育症的15％～20％。绝大部分患有无精子症的男性是因为自身无法产生健康的精子。如果没有健康的精子，即使连试管婴儿技术都无法解决不育问题。因此，寻找一种安全有效的治疗方法是迫在眉睫的。

2、研究发现，干细胞具有归巢作用，回输到患者体内后，会随着血液循环迁移到睾丸。此外，干细胞还具有微环境诱导分化的能力，干细胞在微环境作用下，能进行自我复制和分化，修复受损的睾丸间质细胞和血管组织，提高睾丸功能，增强精子活力，恢复睾丸生精功能。

3、现有技术通过大量激素调节的方式诱导干细胞分化生成精子细胞，但是激素调节的方式副作用较大，易影响细胞分化状态。

4、为了解决上述问题，本专利技术提出一种促进体外人类精子发生的培养液及培养方法。

技术实现思路

1、本专利技术的目的在于提出一种促进体外人类精子发生的培养液及培养方法以解决
技术介绍
中所提出的问题：

2、激素调节的方式副作用较大，易影响细胞分化状态，如何进一步完善诱导干细胞获取足量且健康的精子细胞。

3、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：

4、一种促进体外人类精子发生的培养液及培养方法，包括：100～120ng/ml

5、优选地，所述杜仲叶乙醇提取物由杜仲叶粗粉用50％的乙醇溶液经4次加热回流提取后得到。

6、一种促进体外人类精子发生的培养液的培养方法，包括如下步骤：

7、s1：取2～3mm的减数分裂阻滞的人类睾丸组织用4～5％pfa室温固定1～2h，随后转移至80、90％、无水的梯度酒精中分别浸没1～2min、2～4min、4～8min进行脱水固定，再将切片置于二甲苯与无水乙醇浓度比为1:1的混合溶液中浸没1～2h，再将切片置于二甲苯溶液中，分别浸没3～5min、5～10min进行透明化处理；

8、s2：将透明化处理后的人类睾丸组织标本的各类细胞类型用特异蛋白免疫荧光染色，对细胞核dna采用hoechst 33342进行染色，根据染色结果进行对人类睾丸组织标本进行检测，检测未出现精子细胞标志物pna，则进入下一步；

9、s3：取2～3mm的减数分裂阻滞的人类睾丸组织置于培养皿中，加入1～2ml培养液，于33～37℃、4～5％co2下培养10～15d；

10、s4：组织培养至10～15d后取材，重复s1～s2，再次对染色后的组织进行检测；

11、s5：当s4中检测出现精子细胞标志物pna时，对优化培养液中培养18天后的组织进行倍体流式分选纯化单倍体细胞。

12、优选地，s6中所述分选纯化单倍体细胞具体如下：

13、s6.1：将培养18天后的组织剪碎至糜状；

14、s6.2：加入其10ml浓度为1～2mg/ml的ⅳ型胶原酶溶液，于37℃恒温水浴箱震荡消化处理20～25min，在900～1000r/min离心8～10min；

15、s6.3：取离心沉淀物加入复合酶消化液，并于37℃恒温水浴震荡消化处理30～50min，最后加入1～8％血清替代物终止消化；

16、s6.4：过400目筛网，收集滤液，在900～1000r/min下离心处理8～10min；

17、s6.5：取沉淀物加入含1～8％血清替代物的高糖dmem培养基内重悬，获得单倍体细胞悬液。

18、与现有技术相比，本专利技术提供了一种促进体外人类精子发生的培养液及培养方法，具备以下有益效果：

19、本专利技术在培养液中添加各类激素以及脂肪酸等对细胞进行体外诱导、培养和发育，能够提高细胞在体外的生存能力，且通过本专利技术培养液的培养方法，能够大大提高数据检测准确率和检测精度，提升数据可靠性，通过本专利技术培养液作用于精子细胞的发生全过程；促进健康精子的生成和成熟，为体外男性精子成熟提供技术可能，为治愈无精子症提供平台，恢复患者的生育能力。

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【技术保护点】

1.一种促进体外人类精子发生的培养液，其特征在于，包括：100～120ng/mL dTSSK、1.5～2U/L促卵泡激素、0.5～0.8mg/L巴戟天多糖、5～10μM/L ICA、0.1～5ng/mL亚油酸、0.1～5ng/mLα-亚麻酸、0.5×10-3～1.8×10-3g/mL葡萄糖、0.085～0.225g/mL蔗糖和80～150mg/L左卡尼汀。

2.根据权利要求1所述的一种促进体外人类精子发生的培养液，其特征在于，所述杜仲叶乙醇提取物由杜仲叶粗粉用50％的乙醇溶液经4次加热回流提取后得到。

3.一种根据权利要求1所述的促进体外人类精子发生的培养液的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的一种促进体外人类精子发生的培养液的培养方法，其特征在于，S6中所述分选纯化单倍体细胞具体如下：

【技术特征摘要】

1.一种促进体外人类精子发生的培养液，其特征在于，包括：100～120ng/ml dtssk、1.5～2u/l促卵泡激素、0.5～0.8mg/l巴戟天多糖、5～10μm/l ica、0.1～5ng/ml亚油酸、0.1～5ng/mlα-亚麻酸、0.5×10-3～1.8×10-3g/ml葡萄糖、0.085～0.225g/ml蔗糖和80～150mg/l左卡尼汀。

2.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢俊锋，陈玥舟，
申请(专利权)人：南京元荟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：

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