【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及鉴别陈皮年份，具体为一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法。
技术介绍
1、陈皮是在保护区域内陈化3年或以上的柑皮，具有健脾、化痰的功效，为中药“六陈”之一，传统中医理论认为陈皮“陈久者良”，陈皮经过长期、连续的陈化，逐渐形成自身独特的微生物菌群，在陈化过程中多种菌群的互作会丰富陈皮的风味，引起黄酮类物质等化学物的变化，导致微生物群落组成也会逐渐改变，随着陈化年份的延长，最终形成了对陈皮较为有利微生物菌群。研究发现微生物的种类和其代谢物与陈皮的品质息息相关，但陈皮细菌属、真菌属与挥发性成分、代谢物存在怎样的作用关系，仍鲜有研究报道。
2、高通量测序中的扩增子分析用于描述发酵食品中的微生物演替，高通量测序不仅能获得样品中的微生物群落组成，还能将其相对含量进行数字化，为环境样品中微生物群落的多样性分析提供一种可靠有效的方法。
3、为了探讨陈皮中的微生物菌群及其与陈化过程中化学成分的关系，我们提出一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，包括：
3、总dna提取和pcr扩增模块，微生物总dna提取按照fastdna spin kit for soildna提取试剂盒说明进
4、高通量测序模块，pcr扩增产物经过鉴定、纯化和定量后，按照每个样品的测序量要求进行样品均一化处理；
5、数据处理与分析模块。
6、优选的，高通量测序模块使用nextflex rapid dna-seq kit进行建立测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的扩增产物在illumina hiseq测序平台进行测序。
7、优选的，pcr扩增条件为：在95℃下进行3min的预变性；随后反应30个循环，在95℃下进行30s的变性，在55℃下，退火30s，在72℃下，延伸45s；最后在72℃下稳定延伸10min。
8、优选的，数据处理与分析模块使用fastp(version 0.20.0)软件对原始测序序列进行质量检测，将基因序列进行初步筛选，剔除测序质量较差的数据。
9、优选的，数据处理与分析模块使用flash(version 1.2.7)软件根据pereads之间的overlap对应关系进行拼接，将得到最终的有效数据(effective tags)。
10、优选的，数据处理与分析模块包括otu聚类和物种分析，利用软件uparse(version7.1)将拼接好的tags在97％相近度下聚类为otu，得到otu的代表序列，随后通过软件rdpclassifier version 2.11将otu代表序列与细菌、真菌数据库比对进行物种注释分析，以样品中数据量最少的为标准对各样品的数据进行均一化处理，并在每个分类水平下统计其群落组成，后续分析基于均一化处理后的数据。
11、优选的，数据处理与分析模块包括样品多样性分析，alpha多样性是对单个样品中物种多样性进行分析，包括chao1指数，ace指数，shannon指数以及smpson指数，前3个指数越大说明样品中物种越丰富，shanon指数反映群落的多样性，受样品中群落物种丰富度和物种均匀度影响。
12、一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，采用uplc-ms/ms的多反应检测模式从不同陈化年份陈皮提取液中的总代谢成分进行检测和分析，寻找5个年份陈皮的变化规律并筛选出差异物。
13、优选的，代谢物的提取的方法为：称取50mg的陈皮粉末到离心管中，加入提取液(甲醇水，体积比3:1，-40℃预冷，含内标2-氯苯丙氨酸)700μl，涡旋匀浆4min，4℃超声5min，以上步骤重复3次；将样品置于匀浆机上过夜；样本提取液于2000rpm离心15min后取上清液，每个样本各取30μl混合成qc样本。
14、优选的，代谢物的检测方法为：
15、液相条件：色谱柱waters acquity uplc hss t3(1.8μm 2.1x100 mm)；柱温40℃，自动进样器温度4℃，进样量为2μl；
16、流动相：a相为0.1％甲酸水，b相为乙腈，梯度洗脱，b相比例：0.00-10.00min，2％～50％；11.00～13.00min，50％～95％；13.10～15.00min，95％～2％，流速0.40ml/min：
17、质谱条件：采用多反应监测(mrm)模式采集代谢物信息：
18、离子源参数如下：离子喷雾电压：+5500/-4500v；去簇电压：±100v；气帘气：35psi；雾化源温度：400℃；雾化气体：60psi；辅助加热气：60psi。
19、优选的，数据处理与分析的方法为：对注释到的物质数据信息进行预处理，通过内标物质进行数据归一化处理，利用r语言绘制图表反映样本的整体情况，通过vip值和p＜0.05筛选差异代谢物。
20、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
21、本专利技术通过高通量测序技术测定3、5、10、15、20年陈皮中的微生物组成，得到不同年份陈皮属水平上的优势菌，从微生物层面解释陈皮在陈化过程中的变化规律，最后通过探究微生物与挥发性成分、黄酮类物质的相关关系，进而分析陈化年份对陈皮的具体影响。
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1.一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，其特征在于：包括：
2.根据权利要求1所述的一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，其特征在于：高通量测序模块使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行建立测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的扩增产物在Illumina HiSeq测序平台进行测序。
3.根据权利要求1所述的一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，其特征在于：PCR扩增条件为：在95℃下进行3min的预变性；随后反应30个循环，在95℃下进行30s的变性，在55℃下，退火30s，在72℃下，延伸45s；最后在72℃下稳定延伸10min。
4.根据权利要求1所述的一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，其特征在于：数据处理与分析模块使用FASTP软件对原始测序序列进行质量检测，将基因序列进行初步筛选，剔除测序质量较差的数据。
5.根据权利要求1所述的一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，其特征在于：数据处理与分析模块使用FLAS
6.根据权利要求1所述的一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，其特征在于：数据处理与分析模块包括OTU聚类和物种分析，利用软件UPARSE将拼接好的Tags在97％相近度下聚类为OTU，得到OTU的代表序列，随后通过软件RDP classifierversion 2.11将OTU代表序列与细菌、真菌数据库比对进行物种注释分析，以样品中数据量最少的为标准对各样品的数据进行均一化处理，并在每个分类水平下统计其群落组成，后续分析基于均一化处理后的数据。
7.根据权利要求1所述的一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，其特征在于：数据处理与分析模块包括样品多样性分析，Alpha多样性是对单个样品中物种多样性进行分析，包括Chao1指数，Ace指数，Shannon指数以及Smpson指数，前3个指数越大说明样品中物种越丰富，Shanon指数反映群落的多样性，受样品中群落物种丰富度和物种均匀度影响。
8.一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，其特征在于：采用UPLC-MS/MS的多反应检测模式从不同陈化年份陈皮提取液中的总代谢成分进行检测和分析，寻找5个年份陈皮的变化规律并筛选出差异物。
9.根据权利要求7所述的一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，其特征在于：代谢物的检测方法为：
10.根据权利要求7所述的一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，其特征在于：数据处理与分析的方法为：对注释到的物质数据信息进行预处理，通过内标物质进行数据归一化处理，利用R语言绘制图表反映样本的整体情况，通过VIP值和P＜0.05筛选差异代谢物。
...【技术特征摘要】
1.一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，其特征在于：包括：
2.根据权利要求1所述的一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，其特征在于：高通量测序模块使用nextflex rapid dna-seq kit进行建立测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的扩增产物在illumina hiseq测序平台进行测序。
3.根据权利要求1所述的一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，其特征在于：pcr扩增条件为：在95℃下进行3min的预变性；随后反应30个循环，在95℃下进行30s的变性，在55℃下，退火30s，在72℃下，延伸45s；最后在72℃下稳定延伸10min。
4.根据权利要求1所述的一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，其特征在于：数据处理与分析模块使用fastp软件对原始测序序列进行质量检测，将基因序列进行初步筛选，剔除测序质量较差的数据。
5.根据权利要求1所述的一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，其特征在于：数据处理与分析模块使用flash软件根据pe reads之间的overlap对应关系进行拼接，将得到最终的有效数据。
6.根据权利要求1所述的一种利用微生物菌群和化学计量学手段鉴别陈皮年份的方法，其特征在于：数据处理与分析模块包括otu聚类和物种分析，利用软件uparse将拼接好的tags在97％相近...
【专利技术属性】
技术研发人员：钱敏，董浩，赵文红，白卫东，黄晓媛，李炎鑫，
申请(专利权)人：仲恺农业工程学院，
类型：发明
国别省市：
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