一种还原型辅酶Ｑ１０的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种还原型辅酶Ｑ１０的生产方法，其特征在于：采用所有人和动物的细胞系或细胞株作为生产还原型辅酶Ｑ１０的母本，通过在生物培养剂ＤＭＥＭ－１培养液中进行的细胞培养，获得含有大量还原型辅酶Ｑ１０的细胞液，随后通过离心分离浓缩的方法，或者是先用乙醇萃取浓缩、后冷却结晶的方法获得还原型辅酶Ｑ１０最终产品。与现在已公开的还原型辅酶Ｑ１０生产方法相比较，具有稳定，不被空气的氧氧化；既没有还原剂的残留物，也没有任何抗氧化剂，保护剂等化学残留；能用于食品，药品，化妆品，或者可用于针剂，输液之用，对人体没有免疫原性反应。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种辅酶QlO生产技术，特别是一种以动物细胞生产还原型辅酶QlO 的方法，属于生物制作技术类。
技术介绍
辅酶QlO又名泛醌10，是一种脂溶性醌，在室温下是橙黄色结晶物，熔点48°C，无 臭无味，其结构类似于维生素K，因其母核六位上的侧链(聚异戊二烯基的聚合度为10而得 名)，是一种醌类化合物。它的另一种形式为还原型辅酶Qio，其生理功能主要来源于醌基 的氧化还原特性和类异戊二烯侧链的物理特性，它在人体生理技能中主要有两个作用一 是有明显的抗脂质过氧化作用；二是在营养物质在线粒体内转化为能量的过程中起重要的 作用。其醌环在氧化呼吸链中起传递电子和质子的作用，这种作用不仅是所有生命形式必 不可少的，而且还是形成ATP的关键所在。它作为细胞自身的天然抗氧化剂和细胞代谢激 活剂。具有保护和恢复生物膜结构的完整性，稳定膜电位作用，是肌体的非特异性免疫增强 剂。目前临床应用于心脏病，肝炎等疾病的辅助治疗等方面。在人的肌体内93%是还原型辅酶Q10，7%是氧化型辅酶Q10，起上述2个主要作用 的辅酶QlO是属于还原型辅酶Q10。所以生产还原型辅酶QlO是对人体有直接的积极意义， 特别是天然的还原型辅酶Q10。但是，由于还原型辅酶QlO容易被分子氧氧化，目前还未见 具有工业规模生产还原型辅酶QlO技术方面的报道。此外，由于还原型辅酶QlO是氧化型辅酶QlO的二电子还原体，因此在目前公诸于 世的众多涉及还原型氧辅酶QlO制作技术中，都是通过用还原剂将氧化型辅酶QlO作为原 料，还原生成还原型辅酶Q10。这类制作技术的共同特点，不仅在于都选择氧化辅酶Q10，更 大的一个共同点在于还原过程中大量使用化学还原剂，或者添加有机溶剂类保护剂、添加 剂等。显然将利用上述工艺方法制作的还原型辅酶Q10，在应用于保健食品、饮料、化妆品、 和药品等领域时，不仅在还原型辅酶QlO生产过程中存在对环境的污染问题，而且由于都 存在着分子氧化的问题，因此将其作为食品、饮料、化妆品的功能性添加剂，或者是药品的 组成料等直接或间接作用于人体时，或许其对人体的危害还会远大于辅酶QlO对人体的积 极作用。因此，探寻一种对人体无害化的还原型辅酶QlO工业化生产方法，就成为该技术 领域研究人员的一个重要课题。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提出一种对人体无害化的还原型辅酶QlO工业化生产方法， 既使之区别于现有的用氧化型辅酶QlO生产还原型辅酶QlO方法，更重要的是探索一种无 害的工业化生产还原型辅酶QlO生产工艺，使还原型辅酶QlO产品真正地能造福于人类。这种还原型辅酶QlO的方法，其特征在于采用所有人和动物的细胞系或细胞株 作为生产还原型辅酶QlO的母体，通过在生物培养剂DMEM-I培养液中的细胞培养法获得含有大量还原型辅酶QlO的细胞液，随后通过离心分离浓缩的方法，或者是先用乙醇萃取浓 缩、后冷却结晶的方法获得还原型辅酶QlO最终产品。所采用的人和动物的细胞系或细胞株为肺部细胞系、肝部细胞系、肾部细胞系、 胃肠部细胞系、真皮细胞系、尿道细胞系、生殖细胞系、淋巴细胞系、骨细胞系、骨骼肌细胞 系、脐带细胞系、间叶干细胞系、内皮细胞系等。所述的还原型辅酶QlO的具体生产方法是A、首先取2. 2LpH值为7. 4DMEM-1培养液，将其在121°C下灭菌处理10分钟，而后 加入生产还原型辅酶QlO的细胞的人体细胞系材料，使其在37°C环境下，5%体积的0)2，在 转速300rpm条件下进行48小时的细胞培养，制得含有还原型辅酶QlO的细胞培养液；B、向已制得的细胞培养液中注入克分子浓度为25%的枸橼酸30mL，并对加酸处 理后的培养液进行离心分离处理，将分离后获得的含水物用纯水洗涤数次获得洗净的细胞 体；；C、在洗净的细胞体中重新加入适量的纯水使之成为浆状，通过喷雾干燥处理后获 得干燥细胞体。A、将已干燥的细胞体放入作为提取溶剂的乙醇溶液中，在50°C下搅拌30分钟后， 进行离心分离后除去乙醇溶液相；B、再次加入乙醇，在50°C下搅拌30分钟后，通过过滤得到含有99%的还原型辅酶 QlO提取液；C、先对该提取液进行不少于10小时的冷却处理至4°C，使还原型辅酶QlO析出，得 到还原型辅酶QlO的初次结晶；而后再使用乙醇通过用10小时冷却至10°C，即可得到纯度 为99. 8%的还原型辅酶QlO的结晶。所述的DMEM-I培养液由含4500mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺及不含丙酮酸钠和 碳酸氢钠的HEPES溶液组成。所述HEPES溶液，由238. 3g HEPES溶解在800ml蒸馏水中组成初始溶液，而后加 IM的NaOH水溶液，使pH调至7. 0，然后用蒸馏水定容IOOOml的适用溶液，并于4°C保存。所述的HEPES 缓冲盐溶液由 6g NaCU0. 74g KC1、0. 27gNa2HP04. 2H20、2g 葡聚糖 (glucan or dextran)和IOg HEPES溶解在900ml的蒸馏水配置初始溶液，而后用IM NaOH 调节PH至所需7. 0，再用蒸馏水定容至IOOOml的适用溶液。根据以上技术方案提出的这种还原型辅酶QlO的方法，与现在已公开的还原型辅 酶QlO生产方法相比较，具有以下优点1、稳定，不被空气的氧氧化；2.纯天然产品，没有还原剂的残留物，也没有任何抗氧化剂，保护剂等化学制品；3、用于食品，药品，化妆品，安全可靠；4、用细胞培养法生产还原型辅酶QlO可用于针剂，输液，对人体没有免疫原性反应。具体实施例方式以下结合本专利技术给出的技术方案进一步阐述本专利技术，并给出实施例。实施例1选用人体肝細胞系Fa2N_4 (ATCC-5566)作为生产还原型辅酶QlO母本材料。由DMEM-I ((高葡萄糖)含4500mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和25MmHEPES不 含丙酮酸钠和碳酸氢钠)培养液PH7.4，在2. 2L，DMEM-I培养液的3L细胞发生器，121°C 下灭菌10分钟，加入占培养液体积10%的生产还原型辅酶QlO的母本材料——肝細胞系 Fa2N-4 (ATCC-5566)，在 37°C，5% C02，搅拌转数 300rpm 条件下培养 48 小时。培养结束时，向培养液中加30ml 25%枸橼酸溶液，通过离心分离培养物收集得到 的180g含细胞湿物体，用水洗涤3次后得到洗净细胞体。然后，使用Mulitibeads shocker (多细胞培养振荡器)，B300震荡，搅拌1小时 后，使细胞体破碎，离心分离得到沉淀物。用高效液相色谱法分析，证实所得沉淀物中的还 原型辅酶Q10。最后，在洗净的细胞体中重新加入适量的纯水使之成为浆状，通过喷雾干燥处理 后获得干燥的还原型辅酶QlO的细胞体。使用的培养液按以下方式配置UlOOOml IM HEPES, pH = 7. 0 溶液的配制 将238. 3g HEPES溶解在800ml蒸馏水中，加IM的NaOH水溶液调节至少所需 PH7. 0，然后用蒸馏水定容至1000ml，于4°C保存。2、HEPES缓冲盐溶液的配制将16g NaCl、0.74g KC1、0. 27g Na2HP04. 2H20、2g 葡聚糖(glucan ordextran) 和IOg HEPES溶解在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种还原型辅酶Ｑ１０的生产方法，其特征在于：采用所有人和动物的细胞系或细胞株作为生产还原型辅酶Ｑ１０的母本，通过在生物培养剂ＤＭＥＭ－１培养液中进行的细胞培养，获得含有大量还原型辅酶Ｑ１０的细胞液，随后通过离心分离浓缩的方法，或者是先用乙醇萃取浓缩、后冷却结晶的方法获得还原型辅酶Ｑ１０最终产品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：熊军，宋敬民，娄彩玲，
申请(专利权)人：河南东都生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]