【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物分子生物学领域，具体地说，涉及利用红色荧光蛋白tdtmt标记植物愈伤组织及种子的方法。
技术介绍
1、利用转基因技术能够将具有优良性状的目的基因导入植物基因组中，从而使植物的遗传性状得到改良，打开了改造植物以具有改善的特征或性状的新大门，所述改善的特征或性状例如植物疾病抗性、昆虫抗性、除草剂抗性、产量品质改亮、植物可食用部分的营养质量的改善等。然而转化过程中只有少数植物细胞能够吸收外源dna并整合进植物基因组中，大多数细胞是未转化的。因此，目的基因的引入常常需要借助于筛选标记基因，赋予转化细胞以特定的选择性标记，以便识别和鉴定转基因植物。
2、荧光蛋白作为标记分子本身来源于海洋生物，自身可以发荧光进行光学检测，通用性分子量小对细胞无毒害，不需要外源化学物质处理，具有更高的生物安全性。从1962年下村修等在名为aequorea victoria的水母体内发现并分离得到最早的荧光蛋白绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，gfp)开始，人们对于荧光蛋白的进一步研究和应用从未停止。1999年红色荧光蛋白首次被报道，最早用于研究的红色荧光蛋白是dsred，它是一种从珊瑚中分离出来的红色荧光蛋白，具有荧光强、稳定性好等优势。但其本身也存在许多问题，dsred寡聚状态是四聚体，在进行蛋白融合时容易形成多聚体影响目标蛋白，在细胞内表达会产生毒性，这就促使科学家不得不对其进行结构改造。现代红色荧光蛋白与第一代常规红色荧光蛋白相比有增强的荧光特性和降低的细胞毒性，例如，bindels等研究的
3、蛋白质是稻米种子胚乳中继淀粉后的第二大储藏物质，占糙米干重的8％-10％。按照蛋白质功能可以将他们分为两大类，即作为种子储藏物质的种子储藏蛋白以及维持种子细胞正常代谢的结构蛋白。水稻种子蛋白大多数是储藏蛋白，在子叶或胚乳中形成粒(糊粉层)。主要根据种子蛋白质的溶解性分为4种：碱溶性谷蛋白，醇溶性醇溶蛋白，盐溶性球蛋白和水溶性白蛋白。种子特异性启动子可以驱动外源蛋白或种子自身蛋白在种子中表达储存。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种利用红色荧光蛋白tdtmt标记植物愈伤组织及种子的方法。
2、为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种红色荧光蛋白tdtmt，所述蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：
3、i)如seq id no:2所示的氨基酸序列；或
4、ii)在i)的n端和/或c端连接标签得到的氨基酸序列；或
5、iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。
6、第二方面，本专利技术提供编码所述蛋白tdtmt的核酸分子(tdtomato)，全序列优化后的核苷酸序列如seq id no:1所示。
7、第三方面，本专利技术提供一种生物材料，所述生物材料包含编码所述蛋白tdtmt的核酸分子或表达所述蛋白tdtmt。
8、所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞。
9、第四方面，本专利技术提供一种表达盒，所述表达盒包含启动子-编码所述蛋白tdtmt的核酸分子-终止子。
10、进一步地，所述启动子为组成型启动子、植物种子特异性启动子、水稻或玉米的ubi启动子、actin启动子、rubisco小亚基启动子或cab启动子等中的至少一种；其中，所述组成型启动子优选花椰菜花叶病毒的35s启动子，所述植物种子特异性启动子优选水稻谷蛋白glub-4基因启动子。
11、所述终止子为athsp ter终止子或ubi终止子。
12、优选地，所述启动子为花椰菜花叶病毒的35s启动子和水稻谷蛋白glub-4基因启动子，所述终止子为athsp ter终止子。
13、在本专利技术的一个具体实施方式中，所述表达盒包含如seq id no:3所示的核苷酸序列。
14、第五方面，本专利技术提供所述蛋白tdtmt、编码所述蛋白tdtmt的核酸分子、包含编码所述蛋白tdtmt的核酸分子或表达所述蛋白tdtmt的生物材料，或者所述表达盒的以下任一应用：
15、1)用于植物愈伤组织中通过红色荧光筛选阳性愈伤组织；
16、2)用于转基因植物种子标记；
17、3)用于制备转基因植物。
18、第六方面，本专利技术提供一种利用红色荧光蛋白tdtmt标记植物愈伤组织及种子的方法子的方法，所述方法包括：使植物含有编码所述蛋白tdtmt的核酸分子或表达所述蛋白tdtmt。
19、所述植物包括但不限于水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱或小米。
20、借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
21、(一)本专利技术提供一种利用红色荧光蛋白标记植物种子的方法，通过合成红色荧光蛋白tdtmt基因，将其构建于植物种子特异性启动子下游，遗传转化载体通过农杆菌介导转入水稻胚性愈伤，挑选阳性愈伤组织，分化成苗，其阳性愈伤组织和结实种子在荧光显微镜下观察，转基因种子具有明显红色荧光。该方法可以区分转基因种子和非转基因种子，作物筛选标记，也可以用来标记愈伤组织，作为转化筛选方法。
22、(二)荧光蛋白tdtmt激发波长575nm，发射波长635nm，为红色，具有更强的组织穿透能力，并且更容易与植物自身荧光区分开。
23、(三)该红色荧光蛋白在阳性愈伤组织中表达，通过荧光检测很容易区分转基因种子和非转基因愈伤组织。
24、(四)该红色荧光蛋白在阳性愈伤组织、植物种子中表达，通过荧光检测很容易区分转基因种子和非转基因种子，在转基因标记和生产中有很好的应用前景。
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1.红色荧光蛋白TdTMT，其特征在于，所述蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：
2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求2所述核酸分子或表达权利要求1所述蛋白；
4.表达盒，其特征在于，所述表达盒包含启动子-权利要求2所述核酸分子-终止子。
5.根据权利要求4所述的表达盒，其特征在于，所述启动子为组成型启动子、植物种子特异性启动子、水稻或玉米的Ubi启动子、Actin启动子、Rubisco小亚基启动子或Cab启动子中的至少一种；其中，所述组成型启动子优选花椰菜花叶病毒的35S启动子，所述植物种子特异性启动子优选水稻谷蛋白GluB-4基因启动子；
6.根据权利要求5所述的表达盒，其特征在于，所述启动子为花椰菜花叶病毒的35S启动子和水稻谷蛋白GluB-4基因启动子，所述终止子为AtHSP Ter终止子。
7.根据权利要求6所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。<...
【技术特征摘要】
1.红色荧光蛋白tdtmt，其特征在于，所述蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：
2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子，其特征在于，核苷酸序列如seq id no:1所示。
3.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求2所述核酸分子或表达权利要求1所述蛋白；
4.表达盒，其特征在于，所述表达盒包含启动子-权利要求2所述核酸分子-终止子。
5.根据权利要求4所述的表达盒，其特征在于，所述启动子为组成型启动子、植物种子特异性启动子、水稻或玉米的ubi启动子、actin启动子、rubisco小亚基启动子或cab启动子中的至少一种；其中，所述组成型启动子优选花椰菜花叶病毒的35s启动子，所述植物种子特异性启动子优选水稻谷蛋白glub-4基因启动子；<...
【专利技术属性】
技术研发人员：李应将，陈建南，赵光苗，陈欣妍，安保光，吴永忠，
申请(专利权)人：海南波莲科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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