【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及饲料添加剂领域，具体涉及一种通过向饲料中添加异戊酸钠缓解慢性束缚应激对动物不良影响的方法。
技术介绍
1、近年来，由于大量使用限位栏，无法保证育肥猪活动面积，会对其造成限位栏应激，破坏肠道屏障并导致肠道炎症，影响动物生长性能及心理健康，进而影响畜牧场经济效益。慢性束缚应激模型可以对机体造成无损伤性刺激，并且与限位栏应激所造成的动物损伤在致病过程方面具有形似性，因此在实验室条件下，可用慢性束缚应激模型模拟限位栏应激。
2、肠道屏障是动物机体抵抗病毒及有害物质入侵的第一道屏障，能够阻止病原体入侵，并且具有可以把肠腔内容物和外界分隔开以及保持吸收营养能力的功能。紧密连接蛋白可以维持上皮屏障功能、阻碍有毒大分子和微生物入侵，并且能够选择性调节小分子物质和离子进入体内，是肠道屏障的重要组成部分。紧密连接蛋白减少会导致肠道屏障受损，进而影响动物健康，降低生长性能。应激会破坏动物肠道屏障，引起肠道炎症。慢性束缚应激增加机体肠道氧化应激水平，减少杯状细胞数量以及紧密连接蛋白表达，增加crh和lps水平，诱导肠道上皮细胞凋亡，破坏肠道屏障。应激造成的肠道屏障破坏会导致lps入侵进而激活nf-κb通路并释放炎症因子，从而加重机体的炎症损伤。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供了一种通过向饲料中添加异戊酸钠(iva)缓解慢性束缚应激对动物不良影响的方法，用于探索异戊酸对于慢性束缚应激(chronic restraint stress，crs)的改善作用
2、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种通过向饲料中添加异戊酸钠缓解慢性束缚应激对动物不良影响的方法，包括以下步骤：
3、1)、选择6周龄雄性c57bl/6j小鼠为试验对象，体重20±2g，自由采食和饮水，12小时明暗循环；
4、2)、将小鼠分为5组，分别为空白对照组(con)，慢性束缚应激组(crs)，低剂量异戊酸钠缓解组(1mg/kg iva+crs)，中剂量异戊酸钠缓解组(10mg/kg iva+crs)，高剂量异戊酸钠缓解组(50mg/kg iva+crs)，每组8只小鼠；
5、3)、小鼠慢性束缚应激模型的构建方法为，慢性束缚应激组(crs)、低剂量异戊酸钠缓解组(1mg/kg iva+crs)、中剂量异戊酸钠缓解组(10mg/kg iva+crs)和高剂量异戊酸钠缓解组(50mg/kg iva+crs)的小鼠每天在9：00—15：00之间放入束缚应激装置中进行束缚应激，共持续28天，对照组正常饲养；
6、4)、低剂量异戊酸钠缓解组(1mg/kg iva+crs)、中剂量异戊酸钠缓解组(10mg/kgiva+crs)和高剂量异戊酸钠缓解组(50mg/kg iva+crs)的小鼠每天饲喂添加相应剂量(1mg/kg、10mg/kg、50mg/kg)的异戊酸钠添加饲料，空白对照组(con)和慢性束缚应激组(crs)小鼠每天饲喂普通日粮，共持续28天；
7、5)、在慢性束缚应激模型构建28天后进行悬尾试验，评估各组小鼠抑郁状态；
8、6)、在慢性束缚应激模型构建29天后对各组小鼠进行血清、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑组织(大脑和下丘脑)和肠组织(空肠和结肠)取样；
9、7)、分别取各组小鼠血清通过elisa检测饱感激素分泌情况；
10、8)、分别取各组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏进行称重，计算器官指数；
11、9)、分别取各组小鼠脑组织通过elisa检测5-ht分泌情况；
12、10)、分别取各组小鼠部分肠组织制作石蜡切片并进行h&e染色，观察肠道屏障损伤状况；
13、11)、分别取各组小鼠部分肠组织通过荧光定量以及western blot检测炎症指标。
14、可选地，所述的束缚应激装置为50ml塑料离心管。
15、进一步地，所述的离心管的管壁上分布开设有细孔，且管盖中央开设有小孔。
16、可选地，所述悬尾试验的方法包括：实验开始前将小鼠放入实验室适应30min，实验时，在安静无风的室内，距尾尖1-2cm处用胶带固定尾部，使小鼠头向下悬挂，注意避免形成机械性损伤，小鼠尾部悬挂点距实验台面50cm，记录6min内后4min的小鼠累计不动时间，判定不动的标准是小鼠停止挣扎，身体呈垂直倒悬状态，静止不动。
17、可选地，所述elisa检测方法包括：收集血清和脑组织匀浆。每孔加入1×洗涤缓冲液350μl，静置40s后弃掉液体，重复3次。在空白孔中添加100μl样本稀释液。将100μl不同浓度(不同激素所用elisa试剂盒中标准品的浓度不同)的标准品添加到标品孔中。将50μl样品、50μl样品稀释液添加到抗体包被板的每个样品孔中，使用封板膜封闭板孔，37℃孵育2h。然后从微孔板中除去液体。用洗涤液填充微孔板的每个孔，并在排出洗涤液后将微孔板拍干，上述操作重复五次。每孔加入100μl生物素化抗体工作液，并盖上新的封板膜，37℃孵育1h。弃去孔中液体，洗涤5次后每孔加入100μl链霉亲和素-hrp工作液，并盖上新的封板膜，37℃孵育30min。弃去孔中液体，洗涤5次后每孔加入100μl tmb底物，室温避光孵育20min。然后每孔加入50μl终止液，在450nm处测定各孔的吸光度。
18、可选地，所述荧光定量pcr方法包括：用trizol reagent(invitrogen)试剂盒提取组织总rna。用提取的rna通过first strand cdna synthesis kit(thermo scientific)来制备cdna。使用sybr green检测试剂盒(takara)在480ii(罗氏)上进行定量实时pcr。将0.5μl cdna模板加入总体积为10μl的sybr green混合物中，并加入0.2μl正向或反向引物。通过2-δδct方法进行数据分析。
19、可选地，所述western blot检测方法包括：将结肠组织放入添加pmsf的ripa裂解液，加入磁珠后在匀浆机匀浆，条件50hz，30s/次，匀浆8次，中间间隔10s。匀浆后4℃12000r/min离心10min回收上清。使用bca蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度。蛋白质样品通过sds-page凝胶进行电泳，85v电泳150min。之后通过转膜液转移到pvdf膜。在tbst中用5％的脱脂牛奶或bsa封闭2小时后，将膜与抗nf-κb p65(6956，cst)、phospho-nf-κb p65(3033，cst)和β-actin(t40104，abmart)的一抗在4℃下孵育过夜。使用辣根过氧化物酶结合的二抗以及化学发光显影液观察结果。
20、与现有技术相比，本专利技术至少具备以下有益效果：
21、(1)该方法通过记录日本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种通过向饲料中添加异戊酸钠缓解慢性束缚应激对动物不良影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的通过向饲料中添加异戊酸钠缓解慢性束缚应激对动物不良影响的方法，其特征在于，所述的束缚应激装置为50ml塑料离心管。
3.根据权利要求2所述的通过向饲料中添加异戊酸钠缓解慢性束缚应激对动物不良影响的方法，其特征在于，所述的离心管的管壁上分布开设有细孔，且管盖中央开设有小孔。
4.根据权利要求1所述的通过向饲料中添加异戊酸钠缓解慢性束缚应激对动物不良影响的方法，其特征在于，所述悬尾试验方法包括：实验开始前将小鼠放入实验室适应30min，实验时，在安静无风的室内，距尾尖1-2cm处用胶带固定尾部，使小鼠头向下悬挂，注意避免形成机械性损伤，小鼠尾部悬挂点距实验台面50cm，记录6min内后4min的小鼠累计不动时间，判定不动的标准是小鼠停止挣扎，身体呈垂直倒悬状态，静止不动。
5.根据权利要求1所述的通过向饲料中添加异戊酸钠缓解慢性束缚应激对动物不良影响的方法，其特征在于，所述Elisa检测方法包括：收集血清和脑组织匀浆
6.根据权利要求1所述的通过向饲料中添加异戊酸钠缓解慢性束缚应激对动物不良影响的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR方法包括：用Trizol Reagent试剂盒提取组织总RNA，用提取的RNA通过First Strand cDNA Synthesis Kit来制备cDNA；使用SYBR Green检测试剂盒在480II上进行定量实时PCR；将0.5μL cDNA模板加入总体积为10μL的SYBR Green混合物中，并加入0.2μL正向或反向引物；通过2-ΔΔCt方法进行数据分析。
7.根据权利要求1所述的通过向饲料中添加异戊酸钠缓解慢性束缚应激对动物不良影响的方法，其特征在于，所述Western Blot检测方法包括：将结肠组织放入添加PMSF的RIPA裂解液，加入磁珠后在匀浆机匀浆，条件50Hz，30s/次，匀浆8次，中间间隔10s；匀浆后4℃12000r/min离心10min回收上清；使用BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度；蛋白质样品通过SDS-PAGE凝胶进行电泳，85v电泳150min；之后通过转膜液转移到PVDF膜；在TBST中用5％的脱脂牛奶或BSA封闭2小时后，将膜与抗NF-κB p65、Phospho-NF-κB p65和β-actin的一抗在4℃下孵育过夜；使用辣根过氧化物酶结合的二抗以及化学发光显影液观察结果。
...【技术特征摘要】
1.一种通过向饲料中添加异戊酸钠缓解慢性束缚应激对动物不良影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的通过向饲料中添加异戊酸钠缓解慢性束缚应激对动物不良影响的方法，其特征在于，所述的束缚应激装置为50ml塑料离心管。
3.根据权利要求2所述的通过向饲料中添加异戊酸钠缓解慢性束缚应激对动物不良影响的方法，其特征在于，所述的离心管的管壁上分布开设有细孔，且管盖中央开设有小孔。
4.根据权利要求1所述的通过向饲料中添加异戊酸钠缓解慢性束缚应激对动物不良影响的方法，其特征在于，所述悬尾试验方法包括：实验开始前将小鼠放入实验室适应30min，实验时，在安静无风的室内，距尾尖1-2cm处用胶带固定尾部，使小鼠头向下悬挂，注意避免形成机械性损伤，小鼠尾部悬挂点距实验台面50cm，记录6min内后4min的小鼠累计不动时间，判定不动的标准是小鼠停止挣扎，身体呈垂直倒悬状态，静止不动。
5.根据权利要求1所述的通过向饲料中添加异戊酸钠缓解慢性束缚应激对动物不良影响的方法，其特征在于，所述elisa检测方法包括：收集血清和脑组织匀浆，每孔加入1×洗涤缓冲液350μl，静置40s后弃掉液体，重复3次；在空白孔中添加100μl样本稀释液，将100μl不同浓度的标准品添加到标品孔中；将50μl样品、50μl样品稀释液添加到抗体包被板的每个样品孔中，使用封板膜封闭板孔，37℃孵育2h；然后从微孔板中除去液体；用洗涤液填充微孔板的每个孔，并在排出洗涤液后将微孔板拍干，上述操作重复五次；每孔加入100μl生物素化抗体工作液，并盖上新的封板膜，37℃孵育1h；弃去...
【专利技术属性】
技术研发人员：柴进，郭昶彤，石祥达，王成梅，杨宇轩，黄健，王楠楠，罗冰冰，郑嵘，蒋思文，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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