【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程及生物工程领域，具体涉及到一种糖基转移酶的氨基酸突变体及其应用。
技术介绍
1、糖基转移酶(glycosyltransferase，gt，ec 2.4.xy)是一种可以特异性催化活化的糖连接到不同的受体分子上，生成糖基化产物的一类酶的统称，其催化的底物较为广泛，包括糖、蛋白质、脂质、黄酮、萜类、甾体等化合物。尿苷二磷酸糖基转移酶(udp-glycosyltransferase，ugt)，即以尿苷二磷酸(uridine diphosphate，udp)活化的糖分子作为糖基供体的糖基转移酶，是植物中最大的糖基转移酶超家族，很多与植物激素和次生代谢产物糖基化有关的糖基转移酶都属于该超家族。根据受体分子的糖基化位点，糖基转移酶可被分为o-、n-、c-、s-糖转移酶。其中，天然黄酮苷主要由o-糖基转移酶合成。
2、黄酮糖苷类化合物种类多样，同一个结构的黄酮苷元可以在不同取代位置连接不同种类和数量的糖基供体。在生物合成过程中，它们可由不同类型的糖基转移酶和糖供体催化完成，常见的糖供体有udp-葡萄糖、udp-葡萄糖醛酸、udp-木糖、udp-鼠李糖、udp-阿拉伯糖、udp-半乳糖、udp-半乳糖醛酸及udp-甘露糖等，其中，udp-葡萄糖作为糖供体在黄酮类化合物糖基化的研究中最为广泛，但不同的糖基部分有助于构建黄酮-o-糖苷结构的多样性，并有望能够挖掘获得生物活性更强的黄酮类化合物，如葛根素6″-o-木糖苷比葛根素葡萄糖苷具有更好的抗肿瘤活性，槲皮素-3-o-β-d-木糖苷比槲皮素-3-o-葡萄糖苷具有更
3、芹菜素(apigenin)是一种天然黄酮类化合物，存在于多种植物中，如瑞香科、马鞭草科、卷柏科等植物中。芹菜素具有多种药理活性，如抗肿瘤、心脑血管保护、抗病毒、抗菌等，与其他黄酮类物质(槲皮素、山奈黄酮)相比具有低毒、无诱变性等特点。然而，芹菜素的水溶性低，口服生物利用度差，导致其在动物药理研究及临床中的应用均受到了限制。糖基化修饰是一种可以改善芹菜素生物利用度的有效手段。然而，常见的糖基转移酶催化效率较低，转化能力较差，且大部分只能催化udp-葡萄糖。为进一步提升芹菜素糖基化效率、拓展芹菜素糖苷的种类，一般的研发方向是进一步挖掘、筛选新的糖基转移酶，但难以达到预期效果。
技术实现思路
1、本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
2、鉴于上述和/或现有技术中存在的常见的糖基转移酶催化效率较低，且大多数只能用于udp-葡萄糖催化的问题，提出了本专利技术。
3、本专利技术的其中一个目的是提供一种糖基转移酶的氨基酸突变体，通过基因工程技术，结合生物信息学手段，进一步挖掘糖基转移酶，对具有优良特性或具有一定转木糖基能力的葡萄糖基转移酶实施定向改造，通过单点突变法获得能高效转化芹菜素为芹菜素5-o-木糖苷的方法。
4、为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种糖基转移酶的氨基酸突变体，所述氨基酸突变体是将来源于黍panicum halii gt 1家族的糖基转移酶phugt氨基酸序列的第141位脯氨酸替换为甘氨酸获得；
5、所述氨基酸突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
6、作为本专利技术糖基转移酶的氨基酸突变体的一种优选方案，其中：所述糖基转移酶phugt的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7、本专利技术的另一个目的是提供编码如上所述氨基酸突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
8、本专利技术的另一个目的是提供一种重组质粒，所述重组质粒包含如上所述的基因。
9、本专利技术的另一个目的是提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的重组质粒。
10、作为本专利技术宿主细胞的一种优选方案，其中：所述宿主细胞包括大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的一种。
11、本专利技术的另一个目的是提供一种表达如上所述的氨基酸突变体的重组大肠杆菌。
12、本专利技术的另一个目的是提供如上所述氨基酸突变体在体外转化芹菜素为芹菜素5-o-木糖苷中的应用，利用所述氨基酸突变体，以芹菜素为底物，目标产物为芹菜素-5-o-木糖苷；反应温度为25～55℃，ph 8.0～12.0，芹菜素底物浓度为0.5mm，反应时间为30min；体外转化率为36％。
13、本专利技术的另一个目的是提供如上所述的重组大肠杆菌在体内转化芹菜素为芹菜素5-o-木糖苷中的应用，利用所述重组大肠杆菌，以芹菜素为底物，目标产物为芹菜素5-o-木糖苷；
14、其中，iptg浓度为0.5mm，诱导温度为16～42℃，发酵温度为20～45℃，纤维二糖浓度为0～25g/l，芹菜素底物浓度为1g/l，反应时间72h；体内转化率达80％以上。
15、本专利技术的另一个目的是提供糖基转移酶phugt在体外转化芹菜素中的应用，所述糖基转移酶phugt来源于黍panicum halii gt 1家族，其氨基酸序列如seq id no.1所示；
16、利用所述糖基转移酶phugt，以芹菜素为底物，目标产物为芹菜素-5-o-葡萄糖苷；反应温度为25～55℃，ph 5.5～12.0，芹菜素底物浓度为0.5mm，反应时间为30min；体外转化率达50％以上；同时发现，糖基转移酶phugt体外不能以udp-木糖为糖供体，催化芹菜素转化为芹菜素5-o木糖苷。
17、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
18、本专利技术通过基因工程技术，结合生物信息学手段，进一步挖掘糖基转移酶，对具有优良特性或具有一定转木糖基能力的葡萄糖基转移酶实施定向改造，通过单点突变法获得能高效转化芹菜素为芹菜素5-o-木糖苷的一种新型糖基转移酶突变体phugt-p141g；同时，建立了高效酶法转化芹菜素为芹菜素5-o-木糖苷的方法。
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1.一种糖基转移酶的氨基酸突变体，其特征在于：所述氨基酸突变体是将来源于黍Panicum hallii GT 1家族的糖基转移酶PhUGT氨基酸序列的第141位脯氨酸替换为甘氨酸获得；
2.如权利要求1所述的糖基转移酶的氨基酸突变体，其特征在于：所述糖基转移酶PhUGT的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.编码如权利要求1所述氨基酸突变体的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒包含权利要求3所述的基因。
5.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有权利要求4所述的重组质粒。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包括大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的一种。
7.一种表达如权利要求1所述的氨基酸突变体的重组大肠杆菌。
8.如权利要求1所述氨基酸突变体在体外转化芹菜素为芹菜素5-O-木糖苷中的应用，其特征在于：利用所述氨基酸突变体，以芹菜素为底物，目标产物为芹菜素-5-O-木糖苷；反应温
9.如权利要求8所述的重组大肠杆菌在体内转化芹菜素为芹菜素5-O-木糖苷中的应用，其特征在于：利用所述重组大肠杆菌，以芹菜素为底物，目标产物为芹菜素5-O-木糖苷；
10.糖基转移酶PhUGT在体外转化芹菜素为芹菜素中的应用，其特征在于：所述糖基转移酶PhUGT来源于黍Panicum hallii GT 1家族，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
...【技术特征摘要】
1.一种糖基转移酶的氨基酸突变体，其特征在于：所述氨基酸突变体是将来源于黍panicum hallii gt 1家族的糖基转移酶phugt氨基酸序列的第141位脯氨酸替换为甘氨酸获得；
2.如权利要求1所述的糖基转移酶的氨基酸突变体，其特征在于：所述糖基转移酶phugt的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3.编码如权利要求1所述氨基酸突变体的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
4.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒包含权利要求3所述的基因。
5.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有权利要求4所述的重组质粒。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包括大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的一种。
【专利技术属性】
技术研发人员：赵林果，贾舒童，李琦，裴建军，房仙颖，张小濛，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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