【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是生物工程领域，具体说是涉及一种增强细胞壁合成蛋白基因表达以提高阿卡波糖发酵水平的方法；基于不同麦芽糖添加情况下游动放线菌se50/110的比较蛋白组数据，筛选获得随着麦芽糖浓度提升而提升表达水平的细胞壁合成蛋白acpl_5865，并在游动放线菌se50/110中强化表达细胞壁合成蛋白基因acpl_5865，可以提高游动放线菌se50/110在高浓度麦芽糖添加的培养基中菌体对渗透压的耐受能力，从而可提高阿卡波糖产量。
技术介绍
1、糖尿病是一种代谢性疾病，其突出特点就是高血糖。目前，2型糖尿病是最常见的糖尿病，约占糖尿病患者总数的90％以上。许多的临床研究证明，餐后血糖的合理控制能够有效减缓或减少部分心脑血管慢性并发症的发生，口服降糖药物并结合饮食结构控制与适量运动是行之有效的干预方法。
2、阿卡波糖被列为治疗2型糖尿病的一线用药，其主要是通过竞争性抑制，降低小肠内的葡萄糖苷酶、蔗糖酶、淀粉酶等的活性，减缓多糖类物质分解形成葡萄糖的过程，从而有效降低餐后血糖。单独服用本类药物通常不会发生低血糖等副作用，同时由于阿卡波糖不仅可以降低血糖水平，还具有减小血糖波动、调节体脂代谢和预防心血管疾病等功效，因此，自上市以来便成为治疗2型糖尿病的理想药物。
3、阿卡波糖主要由放线菌产生，游动放线菌se50及其基因工程改造后的高产菌株se50/110都是非常重要的阿卡波糖产生菌。负责阿卡波糖生物合成的相关基因在游动放线菌se50的基因组上成簇分布，组成acb基因簇。在本研究中，通过分析比较蛋白组数据挖掘到
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种增强细胞壁合成蛋白基因表达以提高阿卡波糖发酵水平的方法。通过分析游动放线菌se50/110在不同浓度麦芽糖添加时的比较蛋白组数据，获得随着麦芽糖浓度提升而提升表达水平的细胞壁合成蛋白acpl_5865，并在游动放线菌se50/110中强化表达细胞壁合成蛋白基因acpl_5865，可以增加菌体的细胞壁厚度，从而增强游动放线菌se50/110在高浓度麦芽糖添加的培养基中菌体对渗透压的耐受能力，从而可提高阿卡波糖产量。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
3、本专利技术涉及一种提高阿卡波糖发酵水平的方法，在游动放线菌中强化表达细胞壁合成蛋白的编码基因，获得阿卡波糖高产菌株；所述细胞壁合成蛋白为随着麦芽糖浓度提升而提升表达水平的细胞壁合成蛋白。该菌株发酵得阿卡波糖。
4、作为本专利技术的一个实施方案，所述细胞壁合成蛋白是基于不同麦芽糖添加情况下游动放线菌的比较蛋白组数据，筛选获得的随着麦芽糖浓度提升而提升表达水平的细胞壁合成蛋白。
5、作为本专利技术的一个实施方案，所述游动放线菌为游动放线菌se50，或游动放线菌se50/110。本专利技术在游动放线菌中强化表达游动放线菌se50/110细胞壁合成蛋白基因，获得阿卡波糖高产菌株。
6、作为本专利技术的一个实施方案，所述细胞壁合成蛋白为细胞壁合成蛋白acpl_5865。
7、作为本专利技术的一个实施方案，所述细胞壁合成蛋白的编码基因为序列如seq idno.1所示的细胞壁合成蛋白基因acpl_5865。
8、作为本专利技术的一个实施方案，在游动放线菌se50/110中强化表达细胞壁合成蛋白基因acpl_5865，包括如下步骤：
9、s1，设计并构建用于强化表达细胞壁合成蛋白基因acpl_5865的整合型质粒i；
10、s2，通过接合转移将整合型质粒i导入受体菌株中，然后对突变株进行安普霉素抗性验证，并提取基因组通过pcr产物片段大小的差异，筛选得到基因强化表达突变株。
11、作为本专利技术的一个实施方案，所述整合型质粒i的具体构建方法是，通过pcr扩增的方式分别从游动放线菌se50/110基因组dna中获取(1284bp的)acpl_5865基因片段以及plq648质粒中获取(126bp的)强启动子kasop*基因片段，在质粒plr4的bamhi/ecori位点插入所述kasop*基因片段和acpl_5865基因片段。
12、作为本专利技术的一个实施方案，使用序列如seq id no.2、3所示的引物gbacpl_5865-f/r，通过pcr扩增得到acpl_5865基因。
13、作为本专利技术的一个实施方案，使用序列如seq id no.4、5所示的引物kasop-f/r,通过pcr扩增得到kasop*基因。
14、作为本专利技术的一个实施方案，受体菌株为游动放线菌se50/110，所述基因强化表达突变株记为基因强化表达突变株qsh-p2。
15、作为本专利技术的一个实施方案，所述阿卡波糖高产菌株的发酵包含下列步骤：基因强化表达突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体接种在一级种子培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养30～36小时；按照10％～15％的接种量转接至二级种子培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养24～28小时；按照10％～15％的接种量转接至发酵培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养90～96小时后收取发酵液。作为具体示例，将空载体整合菌株与基因强化表达突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体接种在一级种子培养基中于30℃、220rpm的转速下培养32小时；按照10％的接种量转接至二级种子培养基中于30℃、220rpm的转速下培养24小时；按照15％的接种量转接至发酵培养基中于30℃、220rpm的转速下培养96小时后收取发酵液。
16、作为本专利技术的一个实施方案，所述固体培养基含有质量体积比为3％～5％的蔗糖、0.5％～1％的蛋白胨、0.5％～1％的酵母提取物、0.5％～1％的酪蛋白水解物、0.1％～0.5％的磷酸氢二钾、0.05％～0.1％的氯化钾和0.005％～0.01％的硫酸亚铁。作为具体示例，所述固体培养基含有质量体积比为3％的蔗糖、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.1％的酪蛋白水解物、0.1％的磷酸氢二钾、0.05％的氯化钾和0.005％的硫酸亚铁。
17、作为本专利技术的一个实施方案，所述一级种子培养基含有质量体积比为1.5％～2％的葡萄糖、1％～2％的麦芽糖、1％～2％的麦芽提取物、1％～2％的甘油、0.5％～1％的蛋白胨、0.5％～1％的酵母提取物、0.1％～0.2％的磷酸氢二钾和0.1％～0.2％的酪蛋白水解物。作为具体示例，所述一级种子培养基含有质量体积比为1.5％的葡萄糖、1％的麦芽糖、1％的麦芽提取物、1％的甘油、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.1％的磷酸氢二钾和0.1％的酪蛋白水解物。
18、作为本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，在游动放线菌中强化表达细胞壁合成蛋白的编码基因，获得阿卡波糖高产菌株；所述细胞壁合成蛋白为随着麦芽糖浓度提升而提升表达水平的细胞壁合成蛋白。
2.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述游动放线菌为游动放线菌SE50、或游动放线菌SE50/110。
3.根据权利要求2所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述细胞壁合成蛋白为细胞壁合成蛋白ACPL_5865，所述基因为序列如SEQ ID NO.1所示的细胞壁合成蛋白基因ACPL_5865。
4.根据权利要求3所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，在游动放线菌SE50/110中强化表达细胞壁合成蛋白基因ACPL_5865，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述整合型质粒I的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式分别从游动放线菌SE50/110基因组DNA中获取ACPL_5865基因片段以及pLQ648质粒中获取强启动子kasOp*基因片段，在质粒pLR4的
6.根据权利要求5所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，使用序列如SEQID NO.2、3所示的引物GBACPL_5865-F/R，PCR扩增得到ACPL_5865基因。
7.根据权利要求5所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，使用序列如SEQID NO.4、5所示的引物kasOp-F/R,通过PCR扩增得到kasOp*基因。
8.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述阿卡波糖高产菌株的发酵包含下列步骤：将基因强化表达突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体接种在一级种子培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养30～36小时；按照10％～15％的接种量转接至二级种子培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养24～28小时；按照10％～15％的接种量转接至发酵培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养90～96小时后收取发酵液。
9.一株阿卡波糖高产菌株，其特征在于，在游动放线菌中强化表达序列如SEQ IDNO.1所示的细胞壁合成蛋白基因ACPL_5865构建而得。
10.根据权利要求9所述的阿卡波糖高产菌株，其特征在于，所述游动放线菌为游动放线菌SE50，或游动放线菌SE50/110。
...【技术特征摘要】
1.一种提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，在游动放线菌中强化表达细胞壁合成蛋白的编码基因，获得阿卡波糖高产菌株；所述细胞壁合成蛋白为随着麦芽糖浓度提升而提升表达水平的细胞壁合成蛋白。
2.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述游动放线菌为游动放线菌se50、或游动放线菌se50/110。
3.根据权利要求2所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述细胞壁合成蛋白为细胞壁合成蛋白acpl_5865，所述基因为序列如seq id no.1所示的细胞壁合成蛋白基因acpl_5865。
4.根据权利要求3所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，在游动放线菌se50/110中强化表达细胞壁合成蛋白基因acpl_5865，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述整合型质粒i的具体构建方法是，通过pcr扩增的方式分别从游动放线菌se50/110基因组dna中获取acpl_5865基因片段以及plq648质粒中获取强启动子kasop*基因片段，在质粒plr4的bamhi/ecori位点插入所述kasop*基因片段和acpl_5865基因片段。
6.根据权利要求5所述的提高...
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