本发明专利技术提供了一种细胞周期调节相关基因的基因型检测方法，其特征在于，具体步骤为：采集被测者口腔粘膜样本，抽提基因组ＤＮＡ，基因分型和结果分析。本发明专利技术所需检测的ＤＮＡ可以利用口腔粘膜上皮细胞进行抽提获得。采用口腔粘膜上皮细胞采样方法和器材进行样本采集。样本的ＤＮＡ抽提利用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的ＤＮＡ抽提并进行ＤＮＡ浓度和纯度的测定。本发明专利技术２个位点的基因分型采用ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ技术进行分型。经实验验证，基因分型的准确率达到了９９％以上，重复性达到了１００％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，用于检测CCND1和 STK15基因的变异，属于分子生物学
技术介绍
大样本量中国人群研究证实，细胞周期素CCND1和丝氨酸/苏氨酸激酶STK15基 因的变异在中国人群众普遍存在。以往的检测方法在对CCND1和STK15基因进行检测时出 现的假阳性现象无法很好的排查和解释。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种准确率高的细胞周期调节相关基因的基因型检测方法。 为了达到上述目的，本专利技术的技术方案是提供一种细胞周期调节相关基因的基因 型检测方法，其特征在于，具体步骤为 步骤1.检测的样品类型与采样方法 用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本； 步骤2.基因组DNA的抽提方法 采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小 时一 2. 5小时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测； 步骤3 ，荧光定量PCR反应 将每一个被测者样本分别放入2个反应孔，同时检测2个位点，即细胞周期素 (CCNDl)rs9344和丝氨酸/苏氨酸激酶15 (STK15) s2273535，并增设2个不含DNA模版的 NTC空白对照孔； 在每一个反应孔中加入荧光定量PCR反应体系，其总体积为10iil，即2ia浓度为 20ng/ ii 1的DNA模板、1 iU10X荧光定量PCR反应缓冲液、0. 1 y 1浓度为25mM的合成DNA 的四种脱氧核苷酸底物d NTP、0. 5 ii 1浓度为25mM的氯化镁溶液、0. 02 y 1浓度为5units/ y 1的Taq DNA聚合酶、5. 43 去离子水、0. 225 浓度为20 y M的正向引物、0. 225 浓度为20iiM的反向引物、0. 25iU浓度为10 ii M的VIC荧光探针和0. 25 浓度为10 y M 的FAM荧光探针，其中，2个位点的正向引物、反向引物、带VIC荧光A型探针以及带FAM荧 光G型探针如下 细胞周期素(CCNDl)SEQ ID N01 :Rs9344 : 带VIC荧光A型探针ACCCaGTAAGTGA 带FAM荧光G型探针ACCCgGTAAGTGA 正向引物TGGTGGCCGCAGTGCAAGGC 反向引物TTGGCACCAGCCTCGGCATT 丝氨酸/苏氨酸激酶15 (STK15) SEQ ID N02 :Rs2273535 : 带VIC荧光A型探针AAaTTGCTGAGT 带FAM荧光T型探针AAtTTGCTGAGT 正向引物AGAATTTGAAGGACACAAGA 反向引物TGCCAGAAAGTTTATTTTCT 将反应孔和空白对照孔在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热5(TC、2分钟， 95°C 、 10分钟，然后再进行60个循环的95°C 、30秒，60°C 、 1分钟，反应结束，取出后再放入 荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到细胞周期素(CCNDl)rs9344、丝氨酸/苏氨酸激酶 15(STK15)s2273535两张图; 步骤4 :SNP基因型分析 将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的2个图和一个NTC空白对照进行 比较，每个位点存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM 荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型； (1)、细胞周期素(CCNDl)rs9344 在检测结果图中，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域点为AA基因 型、坐标轴右上区域点为AG基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型； (2)、丝氨酸/苏氨酸激酶15 (STK15) rs2273535 在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为AA基因 型、坐标轴右上区域点为AT基因型、坐标轴右下区域点为TT基因型(该基因型在中国人群 中频率很低)。 本专利技术所需检测的DNA可以利用口腔粘膜上皮细胞进行抽提获得。采用口腔粘膜 上皮细胞采样方法和器材进行样本采集。样本的DNA抽提利用硅胶吸附法进行口腔上皮细 胞的DNA抽提并进行DNA浓度和纯度的测定。本专利技术2个位点的基因分型分别采用PCR技 术及TaqMan⑧-MGB技术进行分型。经重复实验验证，基因分型的准确率达到了 99%以上，重 复性达到了100%。本专利技术增加了一对内参因物的设计避免了假阳性现象，同时适用于大样 本量的基因分型检测。 本专利技术的优点是检测准确率高，可重复性强。 附图说明 图1为细胞周期素(CCND1)SEQ ID N01 :Rs9344基因分型图； 图2为丝氨酸/苏氨酸激酶15(STK15)SEQ ID N02 :Rs2273535基因分型图。具体实施例方式以下结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。 实施例 —种细胞周期调节相关基因的基因型检测方法 步骤1.检测的样品类型与采样方法 用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本； 步骤2.基因组DNA的抽提方法 采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小 时-2. 5小时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测；5 步骤3 ，荧光定量PCR反应 将每一个被测者样本分别放入2个反应孔，同时检测2个位点，即细胞周期素 (CCND1) rs9344、丝氨酸/苏氨酸激酶15 (STK15) s2273535，并增设2个不含DNA模版的NTC 空白对照孔； 在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10 iU，即浓度为 20ng/ ii 1的DNA模板2 ii 1、 1 ii 1 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman MGB、0. 1 ii 1 25mMd NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0. 5iU 25mM氯化镁溶液、0. 02 (5units/ iil)T叫DNA聚合酶、去离子水5.43ia、2个位点分别采用不同的正向引物(20iiM， 0. 225iU)、反向引物(20iiM，0. 225iU)、 VIC荧光探针(lOiiM，O. 25 yl)和FAM荧光探针 (10 ii M， 0. 25 ii 1)工具进行检测(详见下表)；<table>table see original document page 6</column></row><table>将反应孔和空白对照孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，先进行预热50°C、2 分钟，95°C 、 10分钟，然后再进行60个循环的95°C 、30秒，60°C 、 1分钟，反应结束，取出后再 放入ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到细胞周期素(CCNDl)rs9344、丝氨酸/苏氨酸激酶15 (STK15) s2273535两张图； 步骤4 :SNP基因型分析 将ABI7900型荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的2个表和一个NTC空 白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧 光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；如图1所示，为细胞周期 素(CC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种细胞周期调节相关基因的基因型检测方法，其特征在于，具体步骤为： 步骤１．检测的样品类型与采样方法： 用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各２０次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本； 步骤２．基因组ＤＮＡ的抽提方法： 采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组ＤＮＡ，时间为２小时－２．５小时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测； 步骤３，荧光定量ＰＣＲ反应： 将每一个被测者样本分别放入２个反应孔，同时检测２个位点，即细胞周期素ｒｓ９３４４和丝氨酸、丝氨酸／苏氨酸激酶１５ｒｓ２２７３５３５ 在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为ＡＡ基因型、坐标轴右上区域点为ＡＴ基因型、坐标轴右下区域点为ＴＴ基因型。／苏氨酸激酶１５ｓ２２７３５３５，并增设２个不含ＤＮＡ模版的ＮＴＣ空白对照孔； 在每一个反应孔中加入荧光定量ＰＣＲ反应体系，其总体积为１０μｌ，即２μｌ浓度为２０ｎｇ／μｌ的ＤＮＡ模板、１μｌ １０Ｘ荧光定量ＰＣＲ反应缓冲液、０．１μｌ浓度为２５ｍＭ的合成ＤＮＡ的四种脱氧核苷酸底物ｄ ＮＴＰ、０．５μｌ浓度为２５ｍＭ的氯化镁溶液、０．０２μｌ浓度为５ｕｎｉｔｓ／μｌ的Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、５．４３μｌ去离子水、０．２２５μｌ浓度为２０μＭ的正向引物、０．２２５μｌ浓度为２０μＭ的反向引物、０．２５μｌ浓度为１０μＭ的ＶＩＣ荧光探针和０．２５μｌ浓度为１０μＭ的ＦＡＭ荧光探针，其中，２个位点的正向引物、反向引物、带ＶＩＣ荧光Ａ型探针以及带ＦＡＭ荧光Ｇ型探针如下： 细胞周期素ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１：Ｒｓ９３４４：带ＶＩＣ荧光Ａ型探针：ＡＣＣＣａＧＴＡＡＧＴＧＡ 带ＦＡＭ荧光Ｇ型探针：ＡＣＣＣｇＧＴＡＡＧＴＧＡ 正向引物：ＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＣＡＡＧＧＣ 反向引物：ＴＴＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＣＡＴＴ 丝氨酸／苏氨酸激酶１５ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ↓［２］：Ｒｓ２２７３５３５： 带ＶＩＣ荧光Ａ型探针：ＡＡａＴＴＧＣＴＧＡＧＴ 带ＦＡＭ荧光Ｔ型探针：ＡＡｔＴＴＧＣＴＧＡＧＴ 正向引物：ＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＡ 反向引物：ＴＧＣＣＡＧＡＡＡＧＴＴＴＡＴＴＴＴＣＴ 将反应孔和空白对照孔在ＰＣＲ扩增仪上进行反应，先进行预热：５０℃、２分钟，９５℃、１０分钟，然后再进行６０个循环的９５℃、３０秒，６０℃、１分钟，反应结束，取出后再放入荧光...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王校，傅咏南，
申请(专利权)人：上海中优医药高科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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