【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及应用微生物和基因工程，具体是涉及一种产棘白菌素b的基因工程菌及其构建方法和应用
技术介绍
1、棘白菌素类药物是一种新型抗真菌药物，对人体的毒性较低，安全性较好，不存在交叉耐药性已成为近年来的研究热点。现已获得批准上市的棘白菌素类药物包括卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净，其中卡泊芬净和米卡芬净已在国内上市，阿尼芬净未在国内上市。目前，国外生产阿尼芬净的路线，首先由构巢曲霉(aspergillus nidulans)发酵形成先导化合物棘白菌素b(echinocandin b，ecb)，通过脱酰基酶酶解除掉侧链，然后经过化学修饰获得。ecb是一种具有环状六肽核心和脂肪酸侧链结构天然环状脂肽类化合物，是棘白菌素类药物阿尼芬净的前体物质，由于其发酵单位较低，导致阿尼芬净生产难度大、成本高，从而直接影响阿尼芬净的价格及市场前景。目前，可以生产棘白菌素b的菌株有构巢曲霉(aspergillus nidulans)、德拉克洛瓦曲霉(aspergillus delacroxii nrrl 3860)、厚冠突曲霉(aspergillus pachycristatus nrrl 11440)、皱褶曲霉(aspergillus rugulosus)等，皆属于丝状真菌，存在发酵过程高粘度、低氧传递等降低生产效价的限制瓶颈。为提升其发酵效价，在发酵条件优化、诱变育种等方面已开展了大量工作，而通过基因工程改造实现ecb基因工程菌株构建的报道较少。
2、丝状真菌在整个生命周期中呈现复杂的形态学特征，主要有三种：分散的菌丝(disperse
3、透明颤菌血红蛋白是在透明颤菌(vitreoscila)中被发现的第一个血红蛋白。透明颤菌作为一种专性好氧的革兰阴性菌能生存在氧气供应有限的生物环境中，这主要是因为其自身携带透明颤菌血红蛋白编码透明颤菌血红蛋白基因(vhb)，在低氧条件下被诱导表达获得在低氧环境中生存的能力。vhb的主要作用是结合氧，特别是在低o2条件下，vhb可以通过与末端呼吸细胞色素酶直接相互作用将氧传递到呼吸链，可能会增强细胞内的氧化磷酸化。vhb还可以将o2输送到代谢途径中的氧化酶，引起代谢途径中的氧化应激反应，通过与细胞组分(例如脂质，脂肪酸)的相互作用可以改变其氧结合特性。vhb的结构上游有由100多个核苷酸序列构成的启动子区域，该区域有一个强启动子和一个弱启动子，这2个启动子的转录起始位点不同，但都在转录水平上受溶氧水平调控。当溶氧水平低于20％时,启动子开始被诱导，vhb进行表达；当溶氧水平小于2％时，vhb表达量达到最高。vhb能促进细胞内氧的传输，提高氧的利用效率，缓解溶氧对发酵的限制。目前，vhb通过异源表达在动物、植物和微生物中均有应用，特别是在微生物代谢生产性能的强化中应用广泛，但是目前尚无该基因在构巢曲霉中应用于ecb增产的报道。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是针对现有产棘白菌素b的原始菌株中存在发酵过程粘度高、氧传递效率低导致的棘白菌素b效价低的问题，提供一种增强发酵过程氧传递从而提升产物棘白菌素b产量的基因工程菌及其构建方法和应用。
2、本专利技术解决上述技术问题的技术方案具体如下：
3、本专利技术提供一种产棘白菌素b的基因工程菌，其特征在于：在底盘菌构巢曲霉的基因组中被随机整合了来自透明颤菌血红蛋白vhb的表达框架，所述血红蛋白基因表达框包括依次连接的构巢曲霉启动子、透明颤菌血红蛋白基因和构巢曲霉终止子，其中所述透明颤菌血红蛋白基因vhb的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、优选的，所述底盘菌为构巢曲霉(aspergillus nidulans)zjb09223，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号cctcc no.m2012300。
5、优选的，所述构巢曲霉启动子为具有转录激活作用的dna序列。
6、优选的，所述构巢曲霉启动子为构巢曲霉tef1启动子或构巢曲霉gpda启动子。
7、更优选的，所述构巢曲霉启动子为构巢曲霉tef1启动子，所述构巢曲霉tef1启动子的核苷酸序列如seq id no.2所示。
8、优选的，所述构巢曲霉终止子为具有转录终止作用的dna序列。
9、优选的，所述构巢曲霉终止子为构巢曲霉trpc-2终止子、构巢曲霉tef1终止子或构巢曲霉gpda终止子中的一种。
10、更优选的，所述构巢曲霉终止子为构巢曲霉trpc-2终止子，所述构巢曲霉trpc-2终止子的核苷酸序列如seq id no.3所示。
11、更优选的，所述构巢曲霉启动子为构巢曲霉tef1启动子；所述构巢曲霉终止子为构巢曲霉trpc-2终止子。
12、本专利技术提供一种含所述透明颤菌血红蛋白表达框的重组载体。
13、优选的，重组载体为农杆菌自主复制的表达载体，如质粒pdht-sk，当然也可以使用其他载体。该基因工程菌经鉴定并多次传代，发酵性能仍维持稳定。
14、所述的基因工程菌所用菌种可为常规的生产棘白菌素b的菌种，包括构巢曲霉(aspergillus nidulans)、德拉克洛瓦曲霉(aspergillus delacroxii nrrl 3860)、厚冠突曲霉(aspergillus pachycristatus nrrl 11440)、皱褶曲霉(aspergillusrugulosus)。本专利技术所用出发菌株为构巢曲霉(aspergillus nidulans)zjb09223，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号cctccno.m2012300。
15、本专利技术提供一种高产棘白菌素b的重组工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
16、(1)分别克隆启动子、透明颤菌血红蛋白基因和终止子，将启动子、透明颤菌血红蛋白基因和终止子连接，构建适用于构巢曲霉的透明颤菌血红蛋白表达框；
17、(2)以质粒pdht-sk作为模板，以透明本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产棘白菌素B的基因工程菌，其特征在于，在底盘菌构巢曲霉的基因组中随机整合了来自透明颤菌血红蛋白VHB的基因表达框架，所述基因表达框包括依次连接的构巢曲霉启动子、透明颤菌血红蛋白基因和构巢曲霉终止子，其中所述透明颤菌血红蛋白基因VHB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的产棘白菌素B的基因工程菌，其特征在于：所述底盘菌为构巢曲霉(Aspergillus nidulans)ZJB09223，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO.M2012300。
3.如权利要求2所述的产棘白菌素B的基因工程菌，其特征在于：所述构巢曲霉启动子是具有转录激活作用的DNA序列，为构巢曲霉tef1启动子或构巢曲霉gpdA启动子。
4.如权利要求3所述的产棘白菌素B的基因工程菌，其特征在于：所述构巢曲霉终止子是具有转录终止作用的DNA序列，为构巢曲霉trpC-2终止子、构巢曲霉tef1终止子或构巢曲霉gpdA终止子中的一种。
5.如权利要求4所述的产棘白菌素B的基因工程菌，其特征在于：所述构巢曲霉启动子为
6.一种含权利要求1～5中任一项所述产棘白菌素B的基因工程菌的重组载体。
7.一种如权利要求1～5中任一项所述产棘白菌素B的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.如权利要求7所述的产棘白菌素B的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤3)中利用农杆菌介导转化法将透明颤菌血红蛋白基因表达框转化到构巢曲霉中，包括以下步骤：
9.一种如权利要求8所述产棘白菌素B的基因工程菌在发酵制备棘白菌素B中的应用。
10.如权利要求9中所述产棘白菌素B的基因工程菌在发酵制备棘白菌素B中的应用，其特征在于，所述应用为：将所述基因工程菌株接种于发酵培养基中，于25℃、240rpm条件下进行发酵培养9～11天，发酵结束后取发酵液下层沉淀分离纯化即得到棘白菌素B；发酵培养基组成：花生油20g/L，甘油10g/L，蛋白胨8.6g/L，蔗糖9.44g/L，油酸甲酯105g/L，吐温8010.98g/L，L-苏氨酸3.1g/L，L-鸟氨酸盐酸盐6.1g/L，黄豆饼粉40g/L，K2HPO4·3H2O8g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO4·H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，CaCl2 0.3g/L，CuSO4·5H2O 0.6g/L，溶剂为水，pH 6.0-6.8。
...【技术特征摘要】
1.一种产棘白菌素b的基因工程菌，其特征在于，在底盘菌构巢曲霉的基因组中随机整合了来自透明颤菌血红蛋白vhb的基因表达框架，所述基因表达框包括依次连接的构巢曲霉启动子、透明颤菌血红蛋白基因和构巢曲霉终止子，其中所述透明颤菌血红蛋白基因vhb的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.如权利要求1所述的产棘白菌素b的基因工程菌，其特征在于：所述底盘菌为构巢曲霉(aspergillus nidulans)zjb09223，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号cctcc no.m2012300。
3.如权利要求2所述的产棘白菌素b的基因工程菌，其特征在于：所述构巢曲霉启动子是具有转录激活作用的dna序列，为构巢曲霉tef1启动子或构巢曲霉gpda启动子。
4.如权利要求3所述的产棘白菌素b的基因工程菌，其特征在于：所述构巢曲霉终止子是具有转录终止作用的dna序列，为构巢曲霉trpc-2终止子、构巢曲霉tef1终止子或构巢曲霉gpda终止子中的一种。
5.如权利要求4所述的产棘白菌素b的基因工程菌，其特征在于：所述构巢曲霉启动子为构巢曲霉tef1启动子，其核苷酸序列如seq id no.2所示；所述构巢曲霉终止子为构巢曲霉trpc-2终止子，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，李玉蓉，黄良刚，王凯，逄爱萍，张博，周俊平，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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