【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物学与水产种质资源保护及应用领域，具体是一种鉴别地中海弧菌毒素共调菌毛相关致病岛(tcp-pai)的特征序列、特异性鉴定引物及鉴定方法。
技术介绍
1、地中海弧菌(vibrio mediterranei)，是一种存在于海水环境中的革兰氏阴性嗜盐细菌，在细菌分类上是弧菌属的一个种，于1986年从西班牙瓦伦西亚南部两个沿海地区的浮游生物、沉积物和海水中首次鉴定发现，随后又在牡蛎、珊瑚、江珧、黑虎虾和紫菜等多种海洋动植物中被分离报道。这些分离的地中海弧菌大部分作为海洋环境细菌群落正常构成成分被报道，而进一步研究发现地中海弧菌部分菌株对海洋动植物有致病性，是珊瑚白化病、紫菜黄斑病和双壳贝类幼体弧菌病的病原菌。2023年，专利技术人所在团队首次确定并报道了地中海弧菌致病菌株是双壳贝类育苗场幼体弧菌病的病原。通过对不同毒力菌株基因组序列比较发现低毒力菌株的1号染色体上天然缺失一段约10kb的基因群。进一步分析显示该缺失片段有基因组岛的序列特征，其中包含与毒素共调菌毛(tcp)编码基因同源的基因簇，因而将其称为毒素共调菌毛相关致病岛(tcp-pai)。人工感染实验结果显示，携带菌株对毒力显著高于非tcp-pai携带菌株，导致缢蛏和牡蛎幼体更高的死亡率。同时，健康缢蛏幼体中分离到的地中海弧菌菌株均不携带tcp-pai，而自然分离的非tcp-pai携带菌株未显示贝类致病性。这些结果一方面说明自然界中地中海弧菌有tcp-pai(+)和tcp-pai(-)两型，另一方面显示tcp-pai(+)是该物种细菌贝类致病性强毒株的重要基因型
2、有鉴于此，本专利技术人研究和设计了一种地中海弧菌致病岛tcp-pai的快速pcr检测方法以检测携带tcp-pai的高毒力地中海弧菌，本案由此产生。
技术实现思路
1、本专利技术人针对地中海弧菌基因组序列的致病岛(tcp-pai)序列片段，研究和设计了一种鉴别地中海弧菌致病岛的特征序列、特异性鉴定引物及鉴定方法，可快速检测致病岛，以期在致病性地中海弧菌检测中发挥重要作用。本专利技术解决了现有地中海弧菌鉴定方法无法区分tcp-pai携带株和非携带株这一难题。
2、本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：鉴别地中海弧菌致病岛的特征序列，该特征序列位于地中海弧菌基因组1号染色体的基因csir与sspb之间，该特征序列为seq id no.1所示的核苷酸序列。
3、鉴别地中海弧菌致病岛的特异性鉴定引物，该特异性鉴定引物的序列为：
4、上游引物tcpcluster_fwd：5'-ctaacgctagacaaagatcttgatggtg-3'；
5、下游引物tcpcluster_rev：5'-gcgttcctcaagagtttattcaagatgg-3'。
6、鉴别地中海弧菌致病岛的鉴定方法，基于基因csir与sspb之间序列进行特异性鉴定，具体包括以下步骤：
7、(1)将分离得到的地中海弧菌划线于2216e固体培养基上，放置于28℃恒温培养箱过夜培养；
8、(2)挑取单菌落加入到5ml的2216e液体培养基中，放入恒温振荡培养箱中，于28℃、200rpm过夜培养14h；
9、(3)提取地中海弧菌基因组dna，得到dna原液，质检合格后作为pcr模板备用；
10、(4)设计上游引物tcpcluster_fwd和下游引物tcpcluster_rev作为鉴定的特异性鉴定引物，其中，上游引物tcpcluster_fwd为5'-ctaacgctagacaaagatcttgatggtg-3'，下游引物tcpcluster_rev为5'-gcgttcctcaagagtttattcaagatgg-3'；
11、(5)以步骤(3)中提取得到的地中海弧菌基因组dna为模板，将dna原液的浓度定位到300ng/μl，利用设计的特异性鉴定引物进行pcr扩增反应，得到目的片段的pcr产物；
12、(6)将pcr产物在150v、150ma条件下进行0.6％琼脂糖凝胶电泳，得到大小13375bp的产物条带，即为地中海弧菌致病岛的特征序列seq id no.1。
13、作为优选，步骤(5)中pcr扩增反应的反应程序为：95℃预变性2分钟；再进行30个循环：95℃、20秒，57℃、20秒，72℃、4分钟；最后72℃延伸5分钟。
14、与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：专利技术人基于不同毒力地中海弧菌菌株是否含有tcp-pai致病岛相关基因的特点，确定了地中海弧菌tcp-pai致病岛的特征序列，并开发了鉴别地中海弧菌致病岛的特异性鉴定引物及鉴定方法，可以快速检测携带tcp-pai的高毒力地中海弧菌。携带致病岛的地中海弧菌菌株扩增特征序列(csir～sspb)长度为13375bp，而不存在致病岛特征序列(csir～sspb)的序列长度为949bp，可以通过此特异性条带的大小判断地中海弧菌菌株是否携带致病岛。实际应用中，首先利用地中海弧菌特异性引物进行鉴定后，对基因组dna进行提取，并开展致病岛的特异性检测，进而快速、精确地判断疾病病原菌毒力的强弱。本专利技术鉴定方法的优势在于操作简便，无需测序及回复侵染，可快速精确地确定地中海弧菌菌株是否携带致病岛，且实验结果与回复侵染实验结果一致，无错误鉴定菌株。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.鉴别地中海弧菌致病岛的特征序列，其特征在于，该特征序列位于地中海弧菌基因组1号染色体的基因CsiR与sspB之间，该特征序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.鉴别地中海弧菌致病岛的特异性鉴定引物，其特征在于，该特异性鉴定引物的序列为：
3.鉴别地中海弧菌致病岛的鉴定方法，其特征在于，基于基因CsiR与sspB之间序列进行特异性鉴定，具体包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的鉴别地中海弧菌致病岛的鉴定方法，其特征在于，步骤(5)中PCR扩增反应的反应程序为：95℃预变性2分钟；再进行30个循环：95℃、20秒，57℃、20秒，72℃、4分钟；最后72℃延伸5分钟。
【技术特征摘要】
1.鉴别地中海弧菌致病岛的特征序列，其特征在于，该特征序列位于地中海弧菌基因组1号染色体的基因csir与sspb之间，该特征序列为seq id no.1所示的核苷酸序列。
2.鉴别地中海弧菌致病岛的特异性鉴定引物，其特征在于，该特异性鉴定引物的序列为：
3.鉴别地中海弧菌致病岛的鉴定方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：张海燕，邹小慧，薛清刚，刘圣，戴文芳，范聪灵，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：
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