【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、补体系统是一组血浆蛋白质，当其激活时导致靶细胞裂解并通过调理作用促进吞噬作用。补体通过以下三种主要途径由一系列蛋白水解步骤激活：经典激活途径，该途径通常由免疫复合物激活；可由未受保护的细胞表面诱导的替代途径；和甘露糖结合凝集素途径。补体级联的所有三种途径都集中于补体成分5(c5)蛋白的蛋白水解切割。补体成分5(c5)的切割导致片段c5a和c5b的产生，这是在补体级联激活期间起关键作用的过程。c5a可以通过与其受体结合而产生多效性生理反应。c5a是有效的促炎介质，其诱导趋化性迁移，增强细胞粘附，刺激氧化爆发，并诱导各种炎性介质(诸如组胺或细胞因子)的释放。c5b介导了膜攻击复合物(mac或c5b-9)的形成，在补体依赖性细胞毒性(cdc)的晚期导致细胞裂解。此外，在耐受由c5b-9引起的细胞溶解的有核细胞中，c5b-9的亚溶解量可引起细胞激活，这导致细胞增殖、促炎介质的产生以及细胞外基质的产生。
2、仍然需要靶向c5基因的治疗剂来预防和治疗c5相关疾病。
技术实现思路
1、提供了包含向导rna或编码该向导rna的dna的组合物，包含这些组合物的细胞，修饰细胞中的c5基因的方法，修饰c5基因或降低c5基因表达或降低受试者中的补体c5蛋白活性的方法，以及预防、治疗或改善与c5相关的疾病或病症的至少一种症状或适应症的方法。
2、在一个方面，提供了一种包含向导rna或编码该向导rna的dna的组合物，其中该向导rna包含靶向c5基因中的向导rna靶序列
3、在一些此类组合物中，该向导rna靶序列位于该c5基因的编码外显子27、22、21、15、12或1中，或者其中该向导rna靶序列位于该c5基因的编码外显子15或12中。在一些此类组合物中，该c5基因是人c5基因。
4、在一些此类组合物中，该dna靶向区段包含seq id no：33-120中任一项、seq idno：60、65、67、82、85、87、97和119中任一项或seq id no：85和97中任一项所示的序列的至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核苷酸。在一些此类组合物中，该向导rna靶序列包含seq id no：209-296中任一项、seq id no：236、241、243、258、261、263、273和295中任一项或seq id no：261和273中任一项所示的序列的至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核苷酸。在一些此类组合物中，该dna靶向区段与seq id no：33-120中任一项、seq id no：60、65、67、82、85、87、97和119中任一项或seq id no：85和97中任一项所示的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
5、在一些此类组合物中，该dna靶向区段包含seq id no：33-120中任一项、seq idno：60、65、67、82、85、87、97和119中任一项或seq id no：85和97中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成。在一些此类组合物中，该向导rna靶序列包含seq id no：209-296中任一项、seq id no：236、241、243、258、261、263、273和295中任一项或seq id no：261和273中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成。
6、在一些此类组合物中，该组合物包含rna形式的向导rna。在一些此类组合物中，该组合物包含编码向导rna的dna。在一些此类组合物中，该向导rna包含至少一种修饰。在一些此类组合物中，该至少一种修饰包括经2′-o-甲基修饰的核苷酸。在一些此类组合物中，该至少一种修饰包括核苷酸之间的硫代磷酸酯键。在一些此类组合物中，该至少一种修饰包括向导rna的5′末端处的前五个核苷酸中的一个或多个核苷酸处的修饰。在一些此类组合物中，该至少一种修饰包括向导rna的3′末端处的最后五个核苷酸中的一个或多个核苷酸处的修饰。在一些此类组合物中，该至少一种修饰包括向导rna的5′末端处的前四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。在一些此类组合物中，该至少一种修饰包括向导rna的3′末端处的最后四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。在一些此类组合物中，该至少一种修饰包括向导rna的5′末端处的前三个核苷酸处的经2′-o-甲基修饰的核苷酸。在一些此类组合物中，该至少一种修饰包括向导rna的3′末端处的最后三个核苷酸处的经2′-o-甲基修饰的核苷酸。在一些此类组合物中，该至少一种修饰包括：(i)向导rna的5′末端处的前四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(ii)向导rna的3′末端处的最后四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(iii)向导rna的5′末端处的前三个核苷酸处的经2′-o-甲基-修饰的核苷酸；和(iv)向导rna的3′末端处的最后三个核苷酸处的经2′-o-甲基-修饰的核苷酸。在一些此类组合物中，该向导rna包括seq id no：29的经修饰的核苷酸。
7、在一些此类组合物中，该向导rna是单向导rna(sgrna)。在一些此类组合物中，该向导rna包含seq id no：21-29中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成，其中该向导rna包含seq id no：297-312和316-331中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成，其中该向导rna包含seq id no：297-304和316-323中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成，或者其中该向导rna包含seq id no：299、301、318和320中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成。
8、在一些此类组合物中，该向导rna是包含两个单独的rna分子的双向导rna(dgrna)，这些rna分子包括crispr rna(crrna)和反式激活crrna(tracrrna)。在一些此类组合物中，该crrna包含seq id no：16-17中任一项所示的序列。在一些此类组合物中，该tracrrna包含seq id no：18-20中任一项所示的序列。
9、在一些此类组合物中，该组合物与脂质纳米颗粒缔合。在一些此类组合物中，该脂质纳米颗粒包括阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质和隐形脂质。在一些此类组合物中，该阳离子脂质是脂质a。在一些此类组合物中，该中性脂质是dspc。在一些此类组合物中，该辅助脂质是胆固醇。在一些此类组合物中，该隐形脂质是peg2k-dmg。在一些此类组合物中，该阳离子脂质是脂质a，该中性脂质是dspc，该辅助脂质是胆固醇，并且该隐形脂质是peg2k-dmg。
10、在一些此类组合物中，该组合物是包含药学上可接受的载体的药物组合物。
11、在一些此类组合物中，该组合物进一步包含cas蛋白或编本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种组合物，所述组合物包含向导RNA或编码所述向导RNA的DNA，其中所述向导RNA包含靶向C5基因中的向导RNA靶序列的DNA靶向区段，并且其中所述向导RNA与Cas蛋白结合并且将所述Cas蛋白靶向到所述C5基因中的所述向导RNA靶序列。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述向导RNA靶序列位于所述C5基因的编码外显子27、22、21、15、12或1中，或者其中所述向导RNA靶序列位于所述C5基因的编码外显子15或12中。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述C5基因是人C5基因。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述DNA靶向区段包含SEQ ID NO：33-120中任一项、SEQ ID NO：60、65、67、82、
5.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述DNA靶向区段包含SEQ ID NO：33-120中任一项、SEQ ID NO：60、65、67、82、85、87、97和119中任一项或SEQ ID NO：85和97中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成，或者
6.
7.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含编码所述向导RNA的所述DNA。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述向导RNA包含至少一种修饰。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括经2′-O-甲基修饰的核苷酸。
10.根据权利要求8或9所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导RNA的5′末端处的前五个核苷酸中的一个或多个核苷酸处的修饰。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导RNA的3′末端处的最后五个核苷酸中的一个或多个核苷酸处的修饰。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导RNA的所述5′末端处的前四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导RNA的所述3′末端处的最后四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
15.根据权利要求8至14中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导RNA的所述5′末端处的前三个核苷酸处的经2′-O-甲基修饰的核苷酸。
16.根据权利要求8至15中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导RNA的所述3′末端处的最后三个核苷酸处的经2′-O-甲基修饰的核苷酸。
17.根据权利要求8至16中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括：(i)所述向导RNA的所述5′末端处的所述前四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(ii)所述向导RNA的所述3′末端处的所述最后四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(iii)所述向导RNA的所述5′末端处的所述前三个核苷酸处的经2′-O-甲基-修饰的核苷酸；以及(iv)所述向导RNA的所述3′末端处的所述最后三个核苷酸处的经2′-O-甲基-修饰的核苷酸。
18.根据权利要求8至17中任一项所述的组合物，其中所述向导RNA包含SEQ ID NO：29的经修饰的核苷酸。
19.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述向导RNA是单向导RNA(sgRNA)。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述向导RNA包含SEQ ID NO：21-29中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成，其中所述向导RNA包含SEQ ID NO：297-312和316-331中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成，其中所述向导RNA包含SEQ IDNO：297-304和316-323中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成，或者其中所述向导RNA包含SEQ ID NO：299、301、318和320中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成。
21.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述向导RNA是包含两个单独的RNA分子的双向导RNA(dgRNA)，所述RNA分子包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述crRNA包含SEQ ID NO：16-17中任一项所示的序列。
23.根据权利要求21或22所述的组合物...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种组合物，所述组合物包含向导rna或编码所述向导rna的dna，其中所述向导rna包含靶向c5基因中的向导rna靶序列的dna靶向区段，并且其中所述向导rna与cas蛋白结合并且将所述cas蛋白靶向到所述c5基因中的所述向导rna靶序列。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述向导rna靶序列位于所述c5基因的编码外显子27、22、21、15、12或1中，或者其中所述向导rna靶序列位于所述c5基因的编码外显子15或12中。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述c5基因是人c5基因。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述dna靶向区段包含seq id no：33-120中任一项、seq id no：60、65、67、82、
5.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述dna靶向区段包含seq id no：33-120中任一项、seq id no：60、65、67、82、85、87、97和119中任一项或seq id no：85和97中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成，或者
6.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述组合物包含rna形式的所述向导rna。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含编码所述向导rna的所述dna。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述向导rna包含至少一种修饰。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括经2′-o-甲基修饰的核苷酸。
10.根据权利要求8或9所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的5′末端处的前五个核苷酸中的一个或多个核苷酸处的修饰。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的3′末端处的最后五个核苷酸中的一个或多个核苷酸处的修饰。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的所述5′末端处的前四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的所述3′末端处的最后四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
15.根据权利要求8至14中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的所述5′末端处的前三个核苷酸处的经2′-o-甲基修饰的核苷酸。
16.根据权利要求8至15中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的所述3′末端处的最后三个核苷酸处的经2′-o-甲基修饰的核苷酸。
17.根据权利要求8至16中任一项所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括：(i)所述向导rna的所述5′末端处的所述前四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(ii)所述向导rna的所述3′末端处的所述最后四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(iii)所述向导rna的所述5′末端处的所述前三个核苷酸处的经2′-o-甲基-修饰的核苷酸；以及(iv)所述向导rna的所述3′末端处的所述最后三个核苷酸处的经2′-o-甲基-修饰的核苷酸。
18.根据权利要求8至17中任一项所述的组合物，其中所述向导rna包含seq id no：29的经修饰的核苷酸。
19.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述向导rna是单向导rna(sgrna)。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述向导rna包含seq id no：21-29中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成，其中所述向导rna包含seq id no：297-312和316-331中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成，其中所述向导rna包含seq idno：297-304和316-323中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成，或者其中所述向导rna包含seq id no：299、301、318和320中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成。
21.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述向导rna是包含两个单独的rna分子的双向导rna(dgrna)，所述rna分子包括crispr rna(crrna)和反式激活crrna(tracrrna)。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述crrna包含seq id no：16-17中任一项所示的序列。
23.根据权利要求21或22所述的组合物，其中所述tracrrna包含seq id no：18-20中任一项所示的序列。
24.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述组合物与脂质纳米颗粒缔合。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包括阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质和隐形脂质。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述阳离子脂质是脂质a。
27.根据权利要求25或26所述的组合物，其中所述中性脂质是dspc。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的组合物，其中所述辅助脂质是胆固醇。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的组合物，其中所述隐形脂质是peg2k-dmg。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的组合物，其中所述阳离子脂质是脂质a，所述中性脂质是dspc，所述辅助脂质是胆固醇，并且所述隐形脂质是peg2k-dmg。
31.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述组合物是包含药学上可接受的载体的药物组合物。
32.根据任一前述权利要求所述的组合物，所述组合物进一步包含所述cas蛋白或编码所述cas蛋白的核酸。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述cas蛋白是cas9蛋白。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述cas蛋白源自酿脓链球菌cas9蛋白。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含蛋白质形式的所述cas蛋白。
36.根据权利要求32至34中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含编码所述cas蛋白的所述核酸，其中所述核酸包括编码所述cas蛋白的dna，任选地其中所述组合物包含编码所述向导rna的所述dna。
37.根据权利要求32至34中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含编码所述cas蛋白的所述核酸，其中所述核酸包括编码所述cas蛋白的mrna，任选地其中所述组合物包含rna形式的所述向导rna。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中编码所述cas蛋白的所述mrna包含至少一种修饰。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中编码所述cas蛋白的所述mrna经修饰以在一个或多个或所有尿苷位置处包含经修饰的尿苷。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述经修饰的尿苷是n1-甲基-假尿苷。
41.根据权利要求39或40所述的组合物，其中编码所述cas蛋白的所述mrna被n1-甲基-假尿苷完全取代。
42.根据权利要求38至41中任一项所述的组合物，其中编码所述cas蛋白的所述mrna包含5′帽。
43.根据权利要求38至42中任一项所述的组合物，其中编码所述cas蛋白的所述mrna包含poly(a)尾部。
44.根据权利要求37至43中任一项所述的组合物，其中编码所述cas蛋白的所述mrna包含seq id no：339、338或12所示的序列。
45.根据权利要求32至44中任一项所述的组合物，其中编码所述cas蛋白的所述核酸经密码子优化以在哺乳动物细胞或人细胞中表达。
46.根据权利要求32至45中任一项所述的组合物，其中所述cas蛋白包含seq id no：11或8所示的序列。
47.根据任一前述权利要求所述的组合物，所述组合物进一步包含第二向导rna或编码所述第二向导rna的dna，其中所述第二向导rna包含靶向所述c5基因中的第二向导rna靶序列的dna靶向区段，并且其中所述第二向导rna与所述cas蛋白结合并且将所述cas蛋白靶向到所述c5基因中的所述第二向导rna靶序列。
48.根据任一前述权利要求所述的组合物，所述组合物与特异性结合c5的抗原结合蛋白缔合。
49.根据权利要求48所述的组合物，其中特异性结合c5的所述抗原结合蛋白是抗体或其抗原结合片段。
50.根据权利要求48或49所述的组合物，其中特异性结合c5的所述抗原结合蛋白包含：
51.根据权利要求48至50中任一项所述的组合物，其中特异性结合c5的所述抗原结合蛋白是包含免疫球蛋白重链或其可变区或其hcdr1、hcdr2和hcdr3以及免疫球蛋白轻链或其可变区或其lcdr1、lcdr2和lcdr3的单克隆抗体，所述免疫球蛋白重链包含seq id no：697所示的氨基酸序列，所述免疫球蛋白轻链包含seq id no：698所示的氨基酸序列，
52.根据权利要求48至50中任一项所述的组合物，其中特异性结合c5的所述抗原结合蛋白是帕泽利单抗。
53.一种细胞，所述细胞包含根据任一前述权利要求所述的组合物。
54.一种修饰细胞中的c5基因的方法，所述方法包括将根据权利要求32至52中任一项所述的组合物引入到所述细胞中，其中所述向导rna与所述cas蛋白形成复合物并且靶向所述c5基因中的所述向导rna靶序列，并且所述cas蛋白切割所述向导rna靶序列以在所述c5基因中产生靶向遗传修饰。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述cas蛋白的切割在所述c5基因中产生双链断裂。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述cas蛋白的切割在所述c5基因中产生单链断裂。
57.根据权利要求54至56中任一项所述的方法，其中通过非同源末端连接修复所切割的向导rna靶序列来产生所述靶向遗传修饰。
58.根据权利要求54至57中任一项所述的方法，其中所述方法导致所述细胞中所述c5基因的表达或活性降低，或者其中所述方法导致所述细胞中所述c5基因的功能丧失或失活。
59.根据权利要求54至58中任一项所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。
60.根据权利要求54至59中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞，并且所述c5基因是哺乳动物c5基因。
61.根据权利要求54至60中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞，并且所述c5基因是人c5基因。
62.根据权利要求54至61中任一项所述的方法，其中所述细胞是体外或离体的。
63.根据权利要求54至61中任一项所述的方法，其中所述细胞在动物体内。
64.根据权利要求63所述的方法，其中：
65.根据权利要求63或64所述的方法，其中所述方法导致所述动物中补体c5蛋白的血清水平降低，任选地其中补体c5蛋白的血清水平降低至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
66.根据权利要求63至65中任一项所述的方法，其中所述方法导致所述动物中的补体c5蛋白活性降低，任选地其中所述方法导致至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％百分比的经典激活途径溶血抑制，如使用致敏的绵羊红细胞离体测量的。
67.一种修饰细胞中的c5基因的方法，所述方法包括使所述细胞的基因组与以下物质接触：
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述向导rna靶序列位于所述c5基因的编码外显子27、22、21、15、12或1中，或者其中所述向导rna靶序列位于所述c5基因的编码外显子15或12中。
69.根据权利要求67或68所述的方法，其中所述向导rna包含靶向所述向导rna靶序列的dna靶向区段，其中所述dna靶向区段包含seq id no：33-120中任一项、seq id no：60、65、67、82、85、87、97和119中任一项或seq id no：85和97中任一项所示的序列的至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核苷酸、基本上由其组成或由其组成，或者
70.根据权利要求67至69中任一项所述的方法，其中所述向导rna包含靶向所述向导rna靶序列的dna靶向区段，其中所述dna靶向区段包含seq id no：33-120中任一项、seq idno：60、65、67、82、85、87、97和119中任一项或seq id no：85和97中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成，或者
71.根据权利要求67至70中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述细胞中引入：
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述cas蛋白或编码所述cas蛋白的所述核酸和/或所述向导rna或编码所述向导rna的所述dna经由脂质纳米颗粒介导的递送引入到所述细胞中。
73.根据权利要求72所述的方法，其中rna形式的所述向导rna和编码所述cas蛋白的所述核酸经由脂质纳米颗粒介导的递送引入到所述细胞中，其中编码所述cas蛋白的所述核酸是mrna。
74.根据权利要求72或73所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包括阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质和隐形脂质。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述阳离子脂质是脂质a。
76.根据权利要求74或75所述的方法，其中所述中性脂质是dspc。
77.根据权利要求74至76中任一项所述的方法，其中所述辅助脂质是胆固醇。
78.根据权利要求74至77中任一项所述的方法，其中所述隐形脂质是peg2k-dmg。
79.根据权利要求74至78中任一项所述的方法，其中所述阳离子脂质是脂质a，所述中性脂质是dspc，所述辅助脂质是胆固醇，并且所述隐形脂质是peg2k-dmg。
80.根据权利要求71所述的方法，其中所述cas蛋白或编码所述cas蛋白的所述核酸和/或所述向导rna或编码所述向导rna的所述dna经由腺相关病毒引入到所述细胞中。
81.根据权利要求71至80中任一项所述的方法，其中所述方法包括将编码所述cas蛋白的所述核酸引入到所述细胞中。
82.根据权利要求71至81中任一项所述的组合物，其中编码所述cas蛋白的所述核酸经密码子优化以在哺乳动物细胞或人细胞中表达。
83.根据权利要求71至82中任一项所述的方法，其中编码所述cas蛋白的所述核酸包括dna，任选地其中所述方法包括将编码所述向导rna的所述dna引入到所述细胞中。
84.根据权利要求71至82中任一项所述的方法，其中编码所述cas蛋白的所述核酸包括rna，任选地其中所述方法包括将所述向导rna以rna的形式引入到所述细胞中。
85.根据权利要求84所述的方法，其中编码所述cas蛋白的所述rna包含至少一种修饰。
86.根据权利要求85所述的方法，其中编码所述cas蛋白的所述rna经修饰以在一个或多个或所有尿苷位置处包含经修饰的尿苷。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述经修饰的尿苷是n1-甲基-假尿苷。
88.根据权利要求86或87所述的方法，其中编码所述cas蛋白的所述rna被n1-甲基-假尿苷完全取代。
89.根据权利要求85至88中任一项所述的方法，其中编码所述cas蛋白的所述rna包含5′帽。
90.根据权利要求85至89中任一项所述的方法，其中编码所述cas蛋白的所述rna包含poly(a)尾部。
91.根据权利要求84至90中任一项所述的方法，其中编码所述cas蛋白的所述rna包含seq id no：339、338或12所示的序列。
92.根据权利要求71至91中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述向导rna以rna的形式引入到所述细胞中。
93.根据权利要求71至91中任一项所述的方法，其中所述方法包括将编码所述向导rna的所述dna引入到所述细胞中。
94.根据权利要求71至92中任一项所述的方法，其中所述向导rna包含至少一种修饰。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述至少一种修饰包括经2′-o-甲基修饰的核苷酸。
96.根据权利要求94或95所述的方法，其中所述至少一种修饰包括核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
97.根据权利要求94至96中任一项所述的方法，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的5′末端处的前五个核苷酸中的一个或多个核苷酸处的修饰。
98.根据权利要求94至97中任一项所述的方法，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的3′末端处的最后五个核苷酸中的一个或多个核苷酸处的修饰。
99.根据权利要求94至98中任一项所述的方法，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的所述5′末端处的前四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
100.根据权利要求94至99中任一项所述的方法，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的所述3′末端处的最后四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
101.根据权利要求94至100中任一项所述的方法，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的所述5′末端处的前三个核苷酸处的经2′-o-甲基修饰的核苷酸。
102.根据权利要求94至101中任一项所述的方法，其中所述至少一种修饰包括所述向导rna的所述3′末端处的最后三个核苷酸处的经2′-o-甲基修饰的核苷酸。
103.根据权利要求94至102中任一项所述的方法，其中所述至少一种修饰包括：(i)所述向导rna的所述5′末端处的所述前四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(ii)所述向导rna的所述3′末端处的所述最后四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(iii)所述向导rna的所述5′末端处的所述前三个核苷酸处的经2′-o-甲基-修饰的核苷酸；和(iv)所述向导rna的所述3′末端处的所述最后三个核苷酸处的经2′-o-甲基-修饰的核苷酸。
104.根据权利要求94至103中任一项所述的方法，其中所述向导rna包含seq id no：29的经修饰的核苷酸。
105.根据权利要求67至104中任一项所述的方法，其中所述向导rna是单向导rna(sgrna)。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述向导rna包含seq id no：21-29中任一项所示的序列，其中所述向导rna包含seq id no：297-312和316-331中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成，其中所述向导rna包含seq id no：297-304和316-323中任一项所示的序列、基本上由其组成或由其组成，或者其中所述向导rna包含seq id no：299、301、318和320中任一项所示的序列。
107.根据权利要求67至103中任一项所述的方法，其中所述向导rna是包含两个单独的rna分子的双向导rna(dgrna)，所述rna分子包括crispr rna(crrna)和反式激活crrna(tracrrna)。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述crrna包含seq id no：16-17中任一项所示的序列。
109.根据权利要求107或108所述的方法，其中所述tracrrna包含seq id no：18-20中任一项所示的序列。
110.根据权利要求67至109中任一项所述的方法，其中所述cas蛋白是cas9蛋白。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述cas蛋白源自酿脓链球菌cas9蛋白。
112.根据权利要求67至111中任一项所述的方法，其中所述cas蛋白包含seq id no：11或8所示的序列。
113.根据权利要求67至112中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将第二向导rna或编码所述第二向导rna的dna引入到所述细胞中，其中所述第二向导rna与所述cas蛋白形成复合物并且将所述cas蛋白靶向到所述c5基因中的第二向导rna靶序列，并且其中所述cas蛋白切割所述第二向导rna靶序列以在所述c5基因中产生靶向遗传修饰。
114.根据权利要求67至113中任一项所述的方法，其中所述cas蛋白的切割在所述c5基因中产生双链断裂。
115.根据权利要求67至113中任一项所述的方法，其中所述cas蛋白的切割在所述c5基因中产生单链断裂。
116.根据权利要求67至115中任一项所述的方法，其中通过非同源末端连接修复所切割的向导rna靶序列来产生所述靶向遗传修饰。
117.根据权利要求67至116中任一项所述的方法，其中所述方法导致所述细胞中所述c5基因的表达或活性降低，或者其中所述方法导致所述细胞中所述c5基因的功能丧失或失活。
118.根据权利要求67至117中任一项所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。
119.根据权利要求67至118中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞，并且所述c5基因是哺乳动物c5基因。
120.根据权利要求67至119中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞，并且所述c5基因是人c5基因。
121.根据权利要求67至120中任一项所述的方法，其中所述细胞是体外或离体的。
122.根据权利要求67至120中任一项所述的方法，其中所述细胞在动物体内。
123.根据权利要求122所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：基肖尔·德瓦拉拉贾纳拉什姆哈，洛里·莫顿，埃万盖洛斯·普凡尼斯，苏珊娜·哈特福德，阿蒂马亨德拉普拉卡什·坎乔利亚，萨拉·黑塞，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：
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