【技术实现步骤摘要】
本申请属于生物药物领域，尤其涉及一种针对艰难梭状芽胞杆菌外毒素b的蛋白抑制剂、包含其的组合物及其应用。
技术介绍
1、艰难梭菌(clostridioides difficile，又称为艰难梭状芽胞杆菌)是一种机会性腹泻病原体，主要定植在人类结肠，当肠道菌群紊乱时艰难梭菌大量繁殖并导致结肠上皮屏障的破坏。这种破坏进而引发腹泻和结肠炎，严重情况下甚至可能导致肠胃炎相关的死亡。在美国，每年大约有50万例艰难梭菌感染(cdi)(主要是医院和社区获得性)，导致约15,000例死亡。我国炎症性肠病患者中，艰难梭菌的检出率接近欧洲和北美。致病性艰难梭菌分泌三种外毒素，包括毒素a(tcda)、毒素b(tcdb)和艰难梭菌转移酶(cdt)，这些毒素导致肠道损伤。在这三种毒素中，tcdb是致病性菌株在动物模型中所必需的高毒力因子，单独的tcdb就足以在人类中引发多种疾病。
2、tcdb由多个结构域组成，分子量约为270kda。它包括一个n端葡萄糖基转移酶结构域(gtd)、一个半胱氨酸蛋白酶结构域(cpd)、一个传递和受体结合结构域(drbd)以及一个大的c端组合重复寡肽结构域(crops)(参见图1的a)。tcdb利用gtd将小的鸟苷三磷酸酶(gtpase)蛋白葡萄糖化，从而破坏细胞骨架并逐渐导致细胞死亡。
3、tcdb在临床中存在自然变异，并且变异频率较高。根据最近的研究，tcdb可分为至少8个亚型，其中4个亚型(称为tcdb1-4)与人类疾病密切相关(参见图1的b)。这些tcdb变体通过两个分离的界面与不同的宿主受体发生
4、开发中和蛋白疗法作为一种阻止毒素进入宿主细胞的策略，被认为有望治疗cdi。例如，2016年，单克隆抗体bezlotoxumab(zinplava)获得美国食品和药物管理局(fda)批准，用于治疗复发性cdi。bezlotoxumab结合到tcdb的crops结构域的n端，这可能引起第二个rbi的构象变化，并阻止cspg4的结合(参见图1的c)。完全中和tcdb需要同时阻断两个rbi。研究人员开发了纳米体和设计的锚蛋白重复序列(darpins)，通过干扰第一个rbi来中和tcdb。然而，由于不同tcdb亚型之间drbd位点残基的差异，这些蛋白结合物对某些tcdb毒素亚型具有特异性，并且具有窄的结合谱。
5、因此，迫切需要一种广谱的tcdb中和剂，以普遍对抗各种临床tcdb变异。
6、迷你蛋白结合物是由37-65个氨基酸组成的小球状蛋白。它们被专门设计为与目标分子上的结构表位形成形状和化学互补的相互作用。微型蛋白支架具有极高的热稳定性和极低的免疫原性。因此，有必要开发一种针对艰难梭状芽胞杆菌外毒素的迷你蛋白抑制剂。
技术实现思路
1、本专利技术的一个技术目的是提供一种针对艰难梭状芽胞杆菌外毒素b(tcdb)的蛋白抑制剂及其包含其的药物组合物。
2、本专利技术的又一技术目的是提供上述蛋白抑制剂或包含其的药物组合物在制备用于治疗艰难梭状芽胞杆菌外毒素b介导的相关疾病的药物中的用途。
3、一方面，本专利技术提供一种蛋白，其包含(1)选自seq id no.:1和seq id no.:3的氨基酸序列；或(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加1-10个，例如1-8个，1-6个，1-5个，1-4个，1-3个或1-2个氨基酸且具有(1)的活性的由(1)衍生的氨基酸序列。根据本专利技术的所述蛋白可以用作针对艰难梭状芽胞杆菌外毒素b的蛋白抑制剂，可以阻止毒素进入宿主细胞。
4、在一些实施方式中，所述蛋白包含seq id no.:1的氨基酸序列或在seq id no.:1限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加1-10个，例如1-8个，1-6个，1-5个，1-4个，1-3个或1-2个氨基酸且具有seq id no.:1的活性的由seq id no.:1衍生的氨基酸序列，特别是由seq id no.:1的氨基酸序列或由seq id no.:1衍生的氨基酸序列组成，其是针对艰难梭状芽胞杆菌外毒素b的drbd结构域的蛋白抑制剂。
5、在一些实施方式中，所述由seq id no.:1衍生的氨基酸序列如seq idno.:2所示。
6、在使用过程中，根据需要，可以在seq id no.:1的氨基酸序列或其突变体上加入其他功能序列。例如为便于后续使用his-tag对蛋白进行提取，在seq id no.:1或其衍生的氨基酸序列的编码序列前可以加入his-tag和tev酶切位点，但本专利技术不限于此。因此，在一些实施方式中，所述蛋白包含：(1)seq id no.:1的氨基酸序列或在seq id no.:1限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加1-10个，例如1-8个，1-6个，1-5个，1-4个，1-3个或1-2个氨基酸且具有seq id no.:1的活性的由seq id no.:1衍生的氨基酸序列；以及(2)选自his-tag标签和tev酶切位点中的一种或多种。在一些实施方式中，所述蛋白由上述(1)和(2)组成。在一些实施方式中，所述his-tag标签和tev酶切位点的氨基酸序列如seq idno.:4所示。
7、在一些实施方式中，所述蛋白包含seq id no.:3的氨基酸序列或在seq id no.:3限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加1-10个，例如1-8个，1-6个，1-5个，1-4个，1-3个或1-2个氨基酸且具有seq id no.:3的活性的由seq id no.:3衍生的氨基酸序列，其可以更好地结合tcdb的第二个rbi，能够阻断cspg4介导的tcdb进入细胞，从而可以用作艰难梭状芽胞杆菌外毒素b的蛋白抑制剂。
8、在使用过程中，根据需要，可以在seq id no.:3或其衍生的氨基酸序列上加入其他功能序列。例如为便于后续使用his-tag对蛋白进行提取，在seq id no.:3或其衍生的氨基酸序列的编码序列前可以加入h1信号肽及fc标签，在编码序列后可以加入his-tag或flag-tag，但本专利技术不限于此。因此，在一些实施方式中，所述蛋白包含：(1)seq id no.:3的氨基酸序列或在seq idno.:3限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加1-10个，例如1-8个，1-6个，1-5个，1-4个，1-3个或1-2个氨基酸且具有seq id no.:3的活性的由seq idno.:3衍生的氨基酸序列；以及(2)选自h1信号肽、fc标签、his-tag标签和flag-tag标签中的一种或多种。在一些实施方式中，所述蛋白由本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种蛋白，其包含：
2.根据权利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白包含：
3.根据权利要求2所述的蛋白，其中，所述由SEQ ID No.:1衍生的氨基酸序列如SEQ IDNo.:2所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的蛋白，其中，所述蛋白包含：
5.根据权利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白包含：
6.根据权利要求5所述的蛋白，其中，所述蛋白包含：
7.根据权利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID No.:1、SEQID No.:2以及SEQ ID No.:3。
8.一种多核苷酸，其编码如权利要求1至7任一项所述的蛋白。
9.一种重组载体，其包含如权利要求8所述的多核苷酸。
10.一种宿主细胞，其包括如权利要求9所述的重组载体。
11.一种IgG1_Fc同源二聚体，其由两个IgG1_Fc单体构成，其中每个所述IgG1_Fc单体的C端偶联有如权利要求1至7任一项所述的蛋白。
12.一种knob-into-hole型IgG1_
13.根据权利要求12所述的knob-into-hole型IgG1_Fc异源二聚体，其中，所述knob-into-hole型IgG1_Fc异源二聚体中，在所述IgG1_Fcknob组分的C端偶联有氨基酸序列为SEQID No.:3的蛋白；在IgG1_Fchole组分的C端偶联有氨基酸序列为SEQ ID No.:2的蛋白。
14.一种药物组合物，其包含：
15.根据权利要求1至7任一项所述的蛋白、根据权利要求11所述的IgG1_Fc同源二聚体、根据权利要求12或13所述的IgG1_Fc异源二聚体或根据权利要求14所述的药物组合物在制备外毒素B中和剂或者预防或治疗艰难梭状芽胞杆菌感染引起的相关疾病或症状的药物中的用途，特别地，所述艰难梭状芽胞杆菌感染引起的相关疾病或症状包括艰难梭状芽胞杆菌感染引起的腹泻、结肠炎、或炎症性肠病，特别是肠道损伤，或者所述艰难梭状芽胞杆菌感染引起的相关疾病或症状是由TcdB1、TcdB2、TcdB3、TcdB4导致的疾病或症状。
...【技术特征摘要】
1.一种蛋白，其包含：
2.根据权利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白包含：
3.根据权利要求2所述的蛋白，其中，所述由seq id no.:1衍生的氨基酸序列如seq idno.:2所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的蛋白，其中，所述蛋白包含：
5.根据权利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白包含：
6.根据权利要求5所述的蛋白，其中，所述蛋白包含：
7.根据权利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白的氨基酸序列选自seq id no.:1、seqid no.:2以及seq id no.:3。
8.一种多核苷酸，其编码如权利要求1至7任一项所述的蛋白。
9.一种重组载体，其包含如权利要求8所述的多核苷酸。
10.一种宿主细胞，其包括如权利要求9所述的重组载体。
11.一种igg1_fc同源二聚体，其由两个igg1_fc单体构成，其中每个所述igg1_fc单体的c端偶联有如权利要求1至7任一项所述的蛋白。
12.一种knob-into-hole型igg1_fc异源二聚体，其由igg1_fcknob组分和igg1_fchole组分构成，并且其中在所述igg1_fcknob组分的c端偶联有氨基酸序列为...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕莘辰，张媛媛，陶亮，卢培龙，
申请(专利权)人：西湖实验室生命科学和生物医学浙江省实验室，
类型：发明
国别省市：
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